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Las incretinas polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP) y el péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) median las respuestas de insulina que son proporcionales a la ingesta de nutrientes para facilitar la tolerancia a la glucosa1. El receptor de GLP-1 (GLP-1R) es un objetivo farmacológico establecido para el tratamiento de la diabetes y la obesidad2, mientras que el potencial terapéutico del receptor de GIP (GIPR) es un tema de debate. La tirzepatida es un agonista tanto del GIPR como del GLP-1R y es un tratamiento muy eficaz para la diabetes tipo 2 y la obesidad3,4. Sin embargo, aunque la tirzepatida activa GIPR en líneas celulares y modelos de ratón, no está claro si el agonismo dual contribuye a su beneficio terapéutico o cómo lo hace. Las células beta de los islotes expresan tanto el GLP-1R como el GIPR, y la secreción de insulina es un mecanismo establecido por el cual los agonistas de la incretina mejoran el control glucémico5. Aquí, mostramos que en los islotes de ratón, la tirzepatida estimula la secreción de insulina predominantemente a través del GLP-1R, debido a la potencia reducida en el GIPR del ratón. Sin embargo, en los islotes humanos, la actividad antagonizante de GIPR disminuye constantemente la respuesta de la insulina a la tirzepatida. Además, la tirzepatida aumenta la secreción de glucagón y la secreción de somatostatina en los islotes humanos. Estos datos demuestran que la tirzepatida estimula la secreción de hormonas de los islotes de los islotes humanos a través de ambos receptores de incretina.

El eje de la incretina es responsable de la mayor parte de la secreción de insulina posprandial en humanos sanos, y la pérdida del efecto de la incretina contribuye al deterioro del control glucémico en personas con diabetes tipo 26. En base a estas características, el eje de la incretina continúa siendo un objetivo atractivo para el desarrollo de fármacos, y los agonistas de GLP-1R (GLP-1RA) han surgido como tratamientos potentes y efectivos para reducir la glucosa en sangre y el peso corporal7. La evolución continua de esta clase de fármacos ha visto el desarrollo de péptidos únicos que activan múltiples receptores, con secuencias de péptidos de incretina diseñadas para activar receptores adicionales acoplados a proteína G (GPCR)8. Uno de los primeros agonistas de receptores duales monoméricos se dirigía tanto a GLP-1R como a GIPR, y la sinergia entre los dos sistemas de receptores se informó inicialmente hace 10 años. En modelos de ratón, el agonismo dual tuvo una eficacia superior para la pérdida de peso y el control de la glucosa en comparación con un GLP-1RA solo9, con efectos aditivos del GIPR propuesto para actuar a través de la señalización en células beta10, células alfa11, el SNC (sistema nervioso central)12, 13 y adipocitos14. A pesar de los prometedores estudios preclínicos, un ensayo clínico de 12 semanas que usó una iteración de este agonista de incretina dual inicial no logró demostrar superioridad en relación con un monoagonista de GLP-1R15, lo que planteó dudas sobre las estrategias multirreceptoras en humanos.

La tirzepatida es un agonista de ambos receptores de incretina, diseñada a partir de la secuencia peptídica del GIP humano (hGIP). Tiene una vida media promedio de aproximadamente 5 días, lo que permite una dosificación una vez por semana5. La tirzepatida es un agonista desequilibrado que interactúa con el GIPR en mayor medida que con el GLP-1R en sistemas de células cultivadas. Además, tiene un perfil farmacológico in vitro que imita la señalización del GIP nativo en el GIPR, pero está sesgado en el GLP-1R para favorecer la generación de AMP cíclico (cAMP) sobre el reclutamiento de β-arrestina16. En ensayos clínicos, el tratamiento con tirzepatida produjo una pérdida de peso y un control glucémico superiores en comparación con GLP-1RAs3,17, lo que sugiere que el agonismo tanto en GIPR como en GLP-1R es beneficioso en humanos con diabetes tipo 2. Sin embargo, a pesar de la fuerte evidencia de que la tirzepatida involucra al GIPR en ensayos de unión competitiva, experimentos basados en células que usan receptores transfectados y estudios de ratones transgénicos, hay poca evidencia funcional de que la tirzepatida active directamente el GIPR en humanos como parte de su efecto farmacológico sustancial.

Aquí, informamos los resultados de los experimentos con tirzepatida en islotes primarios, un enfoque experimental especialmente adecuado para evaluar si la tirzepatida activa directamente el GIPR en humanos. La actividad del receptor de incretina de las células beta impulsa la secreción de insulina, un componente esencial de la respuesta antidiabética a los agonistas de GLP-1R o GIPR10,18. Además, la célula beta es uno de los pocos tipos de células que expresan ambos receptores de incretina, lo que proporciona un modelo para probar la importancia relativa de la señalización de GIPR frente a GLP-1R. La secuencia de GLP-1 se conserva en especies de roedores y humanos, mientras que la secuencia de GIP difiere entre especies. La tirzepatida está diseñada a partir de la secuencia hGIP5. Es importante destacar que hGIP tiene una potencia reducida en mGIPR19, y se ha sugerido que la tirzepatida también tiene una potencia reducida en mGIPR20. Por lo tanto, nuestra investigación inicial se propuso proporcionar un análisis exhaustivo de la potencia de la tirzepatida en el mGIPR para identificar las limitaciones potenciales del uso de modelos de ratón para estudiar las acciones de la tirzepatida. Evaluamos el compromiso objetivo de mGIP, hGIP y tirzepatida en mGIPR con cuatro enfoques complementarios: (1) ensayos de unión de ligandos; (2) reclutamiento de GαS; (3) activación de proteína G; y (4) generación de cAMP (Tabla 1). En general, el perfil de afinidad-potencia de la tirzepatida fue de 3 a 60 veces más débil en relación con mGIP en mGIPR, con una potencia similar o ligeramente reducida en comparación con GLP-1 en mGLP-1R (Tabla 1 de datos ampliados). Las medidas anteriores de la activación de tirzepatida de los receptores de incretina humanos demostraron una mayor potencia en hGIPR en relación con hGLP-1R16. Con base en estos primeros estudios, se concluyó que la tirzepatida actúa sobre el hGIPR de manera similar al hGIP nativo, pero interactúa con el hGLP-1R con parámetros que difieren del GLP-1 nativo. Sin embargo, este perfil parece diferir para las interacciones de tirzepatida con los receptores de incretina de ratón; por ejemplo, la tirzepatida y el GLP-1 se comportan de manera similar en el mGLP-1R, mientras que la tirzepatida es menos potente en el mGIPR que en el mGIP. Esto sugiere que la actividad desequilibrada de la tirzepatida en realidad puede favorecer la señalización de GLP-1R en células beta murinas y sugiere precaución al usar el compuesto en experimentos con modelos de ratón.

Para abordar la importancia funcional de la tirzepatida en cada receptor de incretina, investigamos el efecto de los enfoques de pérdida de función en la secreción de insulina en ratones. Primero usamos islotes aislados de ratones con eliminación selectiva de Gipr en células beta en combinación con el antagonista de GLP-1R exendina (9-39) (Ex9). La tirzepatida estimuló la secreción de insulina de forma dependiente de la concentración (0-100 nM) en los islotes de control (Fig. 1a). Sin embargo, en comparación con los islotes de control, los islotes knockout de Gipr de células beta secretaron más insulina en respuesta a la tirzepatida (Fig. 1a), mientras que Ex9 bloqueó completamente la secreción de insulina en respuesta a la tirzepatida tanto en los islotes de control como en los knockout (Fig. 1a). Pensamos que la respuesta mejorada en los islotes knockout se atribuyó a una mejora compensatoria en la señalización de GLP-1R que se describió previamente en varios modelos knockout de GIPR10,21,22. Para sortear este problema, utilizamos a continuación el antagonismo farmacológico agudo de los receptores de incretina en islotes de ratón. Aplicamos un antagonista de GIPR de acción prolongada recientemente validado23, que evitó la disminución de la glucosa en respuesta a un agonista de GIPR acilado en ratones de tipo salvaje (Datos extendidos Fig. 1a). El antagonismo del GLP-1R con Ex9 impidió la secreción de insulina en respuesta a tirzepatida, mientras que la presencia de un antagonista de GIPR no tuvo efecto sobre la secreción de insulina estimulada por tirzepatida, sola o en combinación con Ex9 (Fig. 1b). Estos hallazgos sugieren que la tirzepatida funciona predominantemente a través del GLP-1R para estimular la secreción de insulina en los islotes de ratón. Para determinar las consecuencias de estos hallazgos sobre la tolerancia a la glucosa, pretratamos a los ratones con antagonistas acilados de GLP-1R24 o GIPR, solos o en combinación, seguidos de tirzepatida y una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) (Fig. 1b). Utilizamos 3 nmol kg–1 de tirzepatida, identificada como una dosis máxima para reducir la glucosa en ratones de tipo salvaje (Datos ampliados, Fig. 1b), para brindar una oportunidad de actividad en ambos receptores de incretina. Antes de la administración de glucosa, la tirzepatida redujo la glucemia en ayunas, lo que fue impedido por el antagonismo del GLP-1R pero no del GIPR (Fig. 1c). La tirzepatida redujo considerablemente la glucemia durante el IPGTT, un efecto que fue completamente bloqueado por el antagonismo de GLP-1R (Fig. 1d) o cuando los experimentos se realizaron en ratones knockout para Glp1r (Datos extendidos Fig. 1c). En comparación, el antagonismo de GIPR no alteró las acciones de 3 nmol kg–1 de tirzepatida para reducir la glucemia ni influyó en el efecto del antagonista de GLP-1R sobre la tolerancia a la glucosa (Fig. 1d). Se ha demostrado que dosis más altas de tirzepatida muestran actividad en el GIPR5, lo que nos llevó a repetir estos experimentos usando 30 nmol kg–1 de tirzepatida. Encontramos que el antagonismo de GLP-1R solo bloqueó parcialmente los efectos reductores de glucosa de la tirzepatida (Datos extendidos Fig. 1c). Además, mientras que el antagonismo de GIPR por sí solo no logró prevenir los efectos de esta dosis más alta de tirzepatida, se observó un efecto combinado de ambos antagonistas, que previno la disminución de la glucosa en respuesta a la tirzepatida. Estos datos concuerdan con resultados previos que muestran que la tirzepatida puede activar el mGIPR pero requiere altas dosis para hacerlo en ratones.

a, Los islotes de ratón de ratones de control y ratones con deleción específica de células beta de Gipr (Gipr-β-cell-/-) se perfundieron con concentraciones crecientes de tirzepatida (TZP) (0–100 nM) con o sin Ex9 en una concentración de 1 μM que comienza en el minuto 28. Se calculó el iAUC para TZP utilizando el valor en el minuto 42 como referencia. n = 5 para todos los grupos. b, Los islotes de ratón se perfundieron con concentraciones crecientes de TZP (0–100 nM) en presencia de Ex9, un antagonista de GIPR (hormiga GIPR) o una combinación de ambos. Todos los antagonistas se usaron en concentraciones de 1 μM a partir del minuto 28. Se calculó el iAUC para TZP usando el valor en el minuto 42 como referencia. hormiga PBS y GIPR, n = 4; Ex9 y Ex9 + ant GIPR, n = 5. c, Glucemia tras ayuno de 5 h, inmediatamente antes de la administración de glucosa. Los antagonistas se administraron 2 horas antes y la TZP se administró 1 hora antes. n = 8 para todos los grupos. d, Glucemia durante el IPGTT. El iAUC se calculó utilizando el valor de glucemia en ayunas. PBS, TZP y TZP + hormiga GIPR, n = 8; TZP + GLP-1R ant y TZP + GLP-1R/GIPR ant, n = 7. Todos los valores son medias ± sem Las pruebas estadísticas fueron ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Tukey (a) y ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey prueba -hoc (b-d).

Datos fuente

La tirzepatida favorece al GLP-1R sobre el GIPR en los receptores de incretina de ratón, mientras que se ha informado lo contrario para la potencia relativa en los receptores de incretina humanos, para los cuales la actividad de la tirzepatida se inclina hacia el GIPR5,16. Aunque nuestros estudios en ratones sugieren que la tirzepatida estimula la secreción de insulina predominantemente a través del GLP-1R, la diferencia entre especies en la farmacología del receptor puede limitar la extensión de esta interpretación a los humanos25,26. Por lo tanto, a continuación determinamos qué receptor de incretina usa tirzepatida para estimular la secreción de insulina en islotes aislados de donantes humanos. Usamos 30 nM de tirzepatida para alinearnos con las concentraciones publicadas previamente5. En un experimento de un solo donante representativo, la antagonización de GLP-1R no logró reducir la secreción de insulina estimulada por tirzepatida, mientras que la antagonización de GIPR redujo la secreción de insulina en ~55% (Fig. 2a). Debido a la variabilidad de donante a donante asociada con las muestras humanas, repetimos este protocolo en conjuntos adicionales de islotes de humanos que abarcaban un rango de IMC, edad y HbA1C%, e incluían donantes de ambos sexos (Tabla 2 de datos ampliados). En estos estudios, el efecto del antagonismo de GLP-1R varió entre las preparaciones de islotes, y no logró reducir la secreción de insulina estimulada por tirzepatida en casi la mitad de los experimentos (Fig. 2b), mientras que el antagonismo de GIPR disminuyó constantemente la secreción de insulina estimulada por tirzepatida en todos los experimentos. conjuntos de donantes (Fig. 2b). Cuando se promedian todas las preparaciones de islotes y se expresan como una reducción porcentual en relación con las condiciones de control, el antagonismo de GLP-1R por sí solo no redujo significativamente la secreción de insulina, probablemente debido al alto grado de variabilidad entre los distintos donantes (Fig. 2c). Sin embargo, el antagonismo de GIPR solo disminuyó la secreción de insulina estimulada por tirzepatida en relación con el antagonismo de PBS y GLP-1R. Finalmente, la adición de los dos antagonistas no produjo un efecto diferente del antagonismo de GIPR solo. Se observó un resultado similar cuando se utilizó hGIP(3-30) (datos ampliados, fig. 2), un antagonista de GIPR diferente que se ha caracterizado previamente27. Concluimos a partir de estos estudios que los efectos insulinotrópicos de la tirzepatida están mediados por ambos receptores, pero que la contribución de cada receptor varió de un donante a otro; no hubo correlación con las características de los donantes disponibles o la tasa de secreción de insulina estimulada por glucosa. Además, la antagonización de GIPR redujo la secreción de insulina estimulada por tirzepatida en cada conjunto de islotes, lo que demuestra que la actividad en GIPR es necesaria para que tirzepatida estimule la secreción de insulina en islotes humanos aislados.

a, Perifusión de islotes de un conjunto de islotes humanos. La secreción de insulina se midió en respuesta a tirzepatida 30 nM en presencia de Ex9 (1 μM), un antagonista de GIPR (antagonista de GIPR) o ambos. n = 3 por grupo. b, valores iAUC para la secreción de insulina en respuesta a la tirzepatida en ocho conjuntos individuales de islotes humanos. La línea discontinua indica el nivel de secreción de insulina estimulada por glucosa antes de la estimulación con tirzepatida. n = 3 por grupo. c, Datos resumidos de los ocho experimentos en islotes humanos. Cada experimento individual se promedió para producir un solo punto de datos para cada condición y se expresó como un valor relativo a las condiciones de control. Los experimentos individuales tienen líneas de conexión. n = 8. Todos los valores son medias ± sem. La prueba estadística fue ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey (b,c).

Datos fuente

A continuación, aprovechamos las acciones conocidas de los receptores de incretina de los islotes sobre la secreción de glucagón de las células alfa como un enfoque ortogonal para evaluar la contribución relativa de la tirzepatida en cada receptor. El agonismo de GLP-1R tiene acciones bien establecidas para reducir la secreción de glucagón tanto en islotes humanos aislados28 como in vivo29, mientras que el agonismo de GIPR aumenta la secreción de glucagón en modelos preclínicos11 y en humanos30. Curiosamente, se informa que la combinación de GLP-1 y GIP en la secreción de glucagón compensa31,32,33 o disminuye los niveles de glucagón34. Los estudios que muestran que las acciones combinadas de ambos agonistas de los receptores de incretina disminuyen la secreción de glucagón sugieren que las acciones inhibidoras del agonismo de GLP-1R superan las acciones estimulantes del agonismo de GIPR. En islotes humanos aislados, confirmamos que hGIP estimuló la secreción de glucagón, GLP-1 disminuyó la secreción de glucagón y la combinación de los dos péptidos se compensó entre sí para producir una tasa de secreción de glucagón que coincidía con los niveles no estimulados (Fig. 3a). Además, encontramos que la tirzepatida produjo un aumento similar en la secreción de glucagón en comparación con concentraciones molares iguales de hGIP en un conjunto de islotes humanos de un solo donante (Fig. 3b). Curiosamente, la estimulación posterior con hGIP y tirzepatida redujo los efectos sobre la secreción de glucagón, lo que sugiere un grado de desensibilización, aunque solo la tirzepatida produjo un efecto significativo (Fig. 3b). Además, pudimos demostrar que el antagonismo de GIPR, pero no de GLP-1R, bloqueaba por completo la capacidad de hGIP o tirzepatida para estimular la secreción de glucagón (Datos ampliados, Fig. 3). Es de destacar que la secreción de glucagón en diferentes conjuntos de donantes de islotes humanos fue consistente. En todos los conjuntos de islotes, la tirzepatida aumentó de manera constante la secreción de glucagón, aunque la magnitud de la secreción de glucagón varió entre los donantes (Fig. 3c). Este hallazgo demuestra la sólida actividad de la tirzepatida en el GIPR de la célula alfa que supera las acciones inhibitorias producidas por el agonismo de GLP-1R y proporciona evidencia adicional de que la tirzepatida tiene una actividad importante en el GIPR en los islotes humanos. Anteriormente mostramos que la actividad de GIPR en las células alfa potencia la secreción de glucagón estimulada por aminoácidos en islotes de ratón11, y aquí encontramos la misma interacción entre hGIP y aminoácidos en islotes humanos utilizando concentraciones de aminoácidos que se encuentran en el estado posprandial (Figura de datos ampliados 4)11, lo que nos llevó a preguntarnos si la participación de la tirzepatida en el GIPR en los islotes humanos también aumenta el efecto de los aminoácidos en la secreción de glucagón. Curiosamente, encontramos que el efecto de la tirzepatida sobre la secreción de glucagón era independiente de la concentración de glucosa o la presencia de aminoácidos (Fig. 3d), lo que sugiere un mecanismo divergente de hGIP en las células alfa. Finalmente, encontramos que la tirzepatida aumentó constantemente la secreción de somatostatina (Fig. 3e), lo que sugiere un compromiso con las células ẟ que es consistente con la actividad tanto en GIPR como en GLP-1R35,36. Juntos, nuestro trabajo muestra que la tirzepatida produce un aumento en las tres principales hormonas de los islotes, mostrando actividad funcional en ambos receptores de incretina en los islotes humanos.

a, Secreción de glucagón de islotes humanos estimulados con hGIP o GLP-1 30 nM individualmente (minutos 8 a 24) o juntos (minutos 32 a 50) en condiciones de glucosa 16 mM. El iAUC se calculó para los efectos individuales de los péptidos (minutos 8 a 24) y los efectos combinados (minutos 32 a 50) usando el valor del primer punto de tiempo como referencia. GIP, n = 4; GLP-1, n = 6; GIP + GLP-1, n = 10. b, secreción de glucagón de islotes humanos tratados con 30 nM de hGIP o tirzepatida (TZP) en condiciones de glucosa 16 mM. El iAUC se calculó utilizando los minutos 24 y 54 como valores de referencia para la primera y la segunda estimulación, respectivamente. n = 3 para todos los grupos. c, secreción de glucagón en respuesta a TZP 30 nM en ocho conjuntos de donantes individuales de islotes humanos en condiciones de glucosa 16 mM. El resumen de estos experimentos se muestra como los valores promedio de los minutos 55–65. La inducción de veces en el eje y derecho se calculó utilizando los valores de glucagón de referencia de los minutos 35–45. n = 3 para cada donante, n = 8 para datos de resumen. d, secreción de glucagón en islotes humanos (donante R464) estimulada con TZP (30 nM) a glucosa 2,7 mM (2,7 G) o glucosa 10 mM (10 G), con o sin alanina 3 mM. n = 3. e, concentraciones de somatostatina de muestras agrupadas tomadas de muestras de referencia o durante la estimulación con TZP. n = 3. Todos los valores son medias ± sem. Las pruebas estadísticas fueron ANOVA de una vía con la prueba post-hoc de Tukey (a), ANOVA de dos vías con la prueba post-hoc de Sidak (b), prueba t pareada (c, d) y prueba t no pareada (e).

Datos fuente

En resumen, estos resultados proporcionan varios avances importantes en nuestra comprensión de la farmacología de la tirzepatida. En primer lugar, las acciones insulinotrópicas de la tirzepatida en los islotes humanos dependen de la actividad de GIPR. Esto aborda directamente las cuestiones de si la tirzepatida es simplemente un agonista de GLP-1R más potente y si la activación del GIPR contribuye a los resultados metabólicos. El uso de la secreción de insulina como lectura en islotes humanos primarios proporciona una plataforma para interrogar esta pregunta en un sistema que está íntimamente relacionado con los beneficios glucémicos de la tirzepatida. Aunque esta línea de investigación se emprendería mejor con estudios in vivo en humanos con y sin diabetes, la farmacocinética extendida hace que los estudios agudos con tirzepatida dirigidos a la función de las células beta sean un desafío para el diseño. De hecho, la idea de que las acciones insulinotrópicas de GIP están ausentes en sujetos con T2D29 ha estancado el desarrollo de agonistas de GIPR como terapia para la hiperglucemia. Sin embargo, la evidencia emergente requiere que esta idea sea reconsiderada. Primero, un estudio reciente mostró que el antagonismo de GIPR reduce la secreción de insulina durante una prueba de tolerancia a las comidas en sujetos con T2D37,38. Esta observación destaca que el GIP endógeno es esencial incluso en la diabetes tipo 2, lo que sugiere una promesa para los agentes farmacológicos que se dirigen al GIPR. En segundo lugar, la disminución eficaz de la glucosa en sujetos con diabetes tipo 2 durante 4 semanas mejora las acciones insulinotrópicas de GIP y GLP-1 (refs. 39, 40). Por lo tanto, es posible que la actividad relativa de tirzepatida en GLP-1R y GIPR pueda variar en sujetos con y sin diabetes, así como con el grado de hiperglucemia. De hecho, nuestros datos demuestran que incluso entre islotes de donantes no diabéticos, la contribución relativa de GLP-1R versus GIPR a las acciones insulinotrópicas de tirzepatida varía. Esto no sorprende dada la observación de que la sensibilidad de las células beta al GLP-1 en sujetos sanos varía hasta diez veces41. Por lo tanto, una posible explicación de la mayor eficacia de la tirzepatida en el control de la glucemia en relación con el monoagonista GLP-1RA es que al dirigirse a ambos receptores de incretina se mantiene cierta actividad insulinotrópica incluso en sujetos que son relativamente insensibles al GLP-1. Probar estas hipótesis merece un esfuerzo futuro, al igual que la reconsideración de la literatura anterior que ha mostrado atributos positivos del agonismo de GIPR para la función de las células beta10,42,43.

Una segunda observación importante es que la tirzepatida tiene una actividad más débil en relación con mGIP en el mGIPR. En nuestros estudios, antagonizar el GIPR no afectó la secreción de insulina estimulada por tirzepatida ni el control glucémico durante un IPGTT a dosis de 3 nmol kg–1, que identificamos como máximas para reducir la glucosa en ratones. Sin embargo, de acuerdo con nuestros datos sobre la farmacología del receptor, aumentar la dosis a 30 nmol kg–1, diez veces más que las dosis máximas de nuestros estudios, muestra que la tirzepatida tiene actividad insulinotrópica en ratones Glp1r-/- o en presencia de un GLP. -1R antagonista5, lo que demuestra que la tirzepatida puede acoplarse al GIPR en células beta de ratón en concentraciones suficientemente altas. Además, la tirzepatida mejora la sensibilidad a la insulina en ratones Glp1r-/- de una manera que se fenocopia mediante el monoagonismo GIPR14, lo que respalda la actividad de la tirzepatida en el mGIPR. Por lo tanto, no se trata de si la tirzepatida puede activar el mGIPR, sino de qué dosis de tirzepatida se requieren para hacerlo. Una consideración importante es que los patrones de expresión de los receptores de incretina pueden determinar la relación dosis-respuesta a la tirzepatida. En las células beta, que expresan ambos receptores de incretina, la tirzepatida es más potente en el GLP-1R, limitando la actividad en el GIPR con dosis más bajas. Dosis más altas de tirzepatida pueden permitir la participación de mGIPR, pero no está claro si estas dosis altas alteran el efecto de la proporción de actividad GLP-1R:GIPR, lo que podría confundir la interpretación de los resultados. Por el contrario, puede ser que los tipos de células que expresan solo un receptor (como el tejido adiposo, que solo produce GIPR) o ciertas poblaciones neuronales se vean menos afectadas por dosis más altas de tirzepatida. En general, nuestros resultados en ratones resaltan las limitaciones del uso de modelos de ratón para estudiar la tirzepatida, lo que requiere un diseño experimental cuidadoso y una interpretación de los datos en esta especie.

Una última conclusión importante de estos estudios es el fuerte aumento de la secreción de glucagón inducida por la tirzepatida. Este hallazgo encaja con el cuerpo de la literatura que demuestra que la actividad de GIPR en los islotes estimula la secreción de glucagón11. Nuestro hallazgo de que la tirzepatida aumenta la secreción de glucagón en islotes aislados no solo demuestra una actividad significativa en el GIPR sino que también proporciona evidencia de que la tirzepatida puede superar la actividad en el GLP-1R sobre la secreción de glucagón en los islotes humanos. Nuestros estudios evalúan directamente el efecto de la tirzepatida en la secreción de glucagón, pero los ensayos clínicos con tirzepatida han informado reducciones tanto en el glucagón en ayunas como en la respuesta del glucagón en un desafío con comidas mixtas17. Aunque estos datos parecen estar en conflicto con nuestra observación de que la tirzepatida estimula la actividad de las células alfa, es importante señalar que el perfil metabólico de los sujetos en el brazo de tirzepatida mejoró drásticamente durante el período de 28 semanas, lo que complica las interpretaciones. De hecho, el aumento del estrés metabólico eleva la actividad de las células alfa y beta de manera compensatoria, elevando los niveles de insulina y glucagón tanto en ayunas como estimulados. Por el contrario, las reducciones en el peso corporal y las mejoras en el control glucémico disminuirán la actividad compensatoria de las células alfa y beta, reduciendo los niveles de insulina y glucagón. Por ejemplo, los sujetos tratados con tirzepatida también mostraron una reducción en los niveles de insulina en ayunas y estimulada, datos que no han llevado a la conclusión de que la tirzepatida inhibe la secreción de insulina. Las implicaciones de la secreción de glucagón estimulada por tirzepatida justifican una mayor investigación, pero sugieren nuevas hipótesis centradas en los posibles beneficios metabólicos del agonismo del glucagón. Esto es particularmente interesante ya que los agonistas multirreceptores de próxima generación que incorporan el agonismo del receptor de glucagón se han mostrado tremendamente prometedores para la pérdida de peso y el control glucémico, incluidos los triagonistas para GLP-1R, GIPR y GCGR44,45.

Nuestros estudios en islotes humanos aislados demuestran claramente una acción robusta de la tirzepatida en el GIPR, tanto en células beta como en células alfa. Es importante tener en cuenta que, aunque los islotes humanos que usamos provenían de donantes con una amplia gama de características metabólicas, no tuvimos la oportunidad de incluir islotes de donantes con diabetes tipo 2. Además, los islotes aislados proporcionan un sistema cerrado que no incorpora toda la gama de regulación presente en la fisiología sistémica y puede que no recapitule con precisión detalles adicionales como la tasa de flujo sanguíneo o las concentraciones de péptidos libres, lo que destaca algunas de las limitaciones de este modelo. Por lo tanto, es importante extender estos estudios a sujetos humanos usando inhibidores potentes de los receptores de incretina. Sin embargo, los datos presentados aquí demuestran claramente que en islotes humanos aislados, la tirzepatida requiere que el GIPR estimule la secreción de insulina y glucagón.

Las células HEK293T se mantuvieron a 37 °C en CO2 al 5 % y se cultivaron en DMEM (n.º de cat. 11995073; Life Technologies) complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (FBS, n.º de cat. 10500064; Life Technologies), 100 UI ml–1 de penicilina y 100 μg ml–1 de solución de estreptomicina (penicilina-estreptomicina, n.º de cat. P4333; Sigma–Aldrich). Mientras aún estaban en fase logarítmica, se sembraron células HEK293T (700 000 por pocillo) en placas de 6 pocillos (n.º de cat. 10234832; Fisher Scientific GmbH) en DMEM (10 % FBS, 1 % penicilina-estreptomicina). Veinticuatro horas después de alcanzar el 70 % de confluencia, se realizaron transfecciones transitorias utilizando Lipofectamine 2000 (n.º de cat. 11668019; Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células HEK293T se lavaron con PBS y se resuspendieron en medios completos sin rojo de fenol FluoroBrite (n.º de cat. A1896701; Life Technologies) que contenían FBS al 5 % y L-glutamina 2 mM (n.º de cat. 25030081). ; Gibco). Luego, 100 000 células por pocillo se sembraron en placas LumiNunc de poliestireno blanco de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (n.º de cat. P6403; Sigma-Aldrich) (n.º de cat. 10072151; Fisher Scientific). Después de 24 h, el medio se reemplazó con HBSS (n.º de cat. 14025092; Gibco) que contenía 10 μM de coelenterazina-h (n.º de cat. S2011; Promega) o una dilución 1:500 de NanoGlo (n.º de cat. N1110; Promega ). Las mediciones de BRET se tomaron cada 1 min utilizando un lector de microplacas multimodo PHERAstar FS. Las medidas de referencia se tomaron después de una incubación inicial de 5 min con coelenterazina-h o HBSS que contenía NanoGlo, después de lo cual las células se trataron con un vehículo (PBS) o los ligandos respectivos. Las señales BRET radiométricas específicas del ligando se normalizaron con respecto al vehículo, lo que produjo la "proporción BRET inducida por ligando"46, seguida de una normalización adicional a las lecturas de referencia específicas del pocillo. Las mediciones inducidas por ligando en la escala temporal se representan como la medición posterior después del punto de tiempo cero. Se calculó el área incremental positiva o negativa bajo las curvas (+iAUC, –iAUC) donde se indicó. Las curvas de concentración-respuesta se generaron mediante un ajuste logístico de tres parámetros en Prism 9.0.

Se prepararon membranas de células HEK que expresan GLP-1R y GIPR humanos y de ratón clonados como se describió previamente47. Se realizó un método de unión competitiva para cuantificar el desplazamiento de radioligandos de GLP-1 y GIP yodados a sus receptores afines como se describe en la ref. 16, con las siguientes modificaciones. El tampón de ensayo estaba compuesto por MgCl2 2,5 mM, CaCl2 1,0 mM, Tween 20 al 0,003 % p/v, bacitracina al 0,1 % p/v (USB corporation) en HEPES 25 mM, pH 7,4. Aproximadamente 0,05 nM de radioligando ([125I]GLP-1(7-36)NH2 humano/ratón y [125I]GIP(1-42)OH humano; ambos PerkinElmer >2200 Ci mmol–1, >95 % de pureza) se añadió a péptido en 100 μl de tampón de ensayo (curvas de concentración-respuesta en DMSO, concentración final de 0,96 %) en placas de 96 pocillos (cat. n.º 3632; Corning). Se añadió tampón de ensayo (100 μl) que contenía membranas que se habían preincubado a temperatura ambiente con WGA-PVT SPA Beads (PerkinElmer) durante 2 h. Las cantidades de membrana y perlas fueron las siguientes: hGLP-1R (0,35 μg de proteína, 0,125 mg de perla), mGLP-1R (0,25 μg de proteína, 0,125 mg de perla), hGIPR (6 μg de proteína, 0,2 mg de perla) y mGIPR (7 μg de proteína , 0,25 mg de perla). Las placas se cubrieron con cinta adhesiva (Perkin Elmer), se mezclaron y se incubaron durante 14 a 16 horas a temperatura ambiente. Las placas se centrifugaron a 200 xg durante 5 min y la radiactividad unida se cuantificó utilizando un contador de centelleo (MicroBeta Trilux, PerkinElmer). La unión total fue la cantidad de radioligando unido en ausencia de un competidor. La unión no específica se definió mediante 100 nM de GLP-1(7-36) o GIP(1-42)NH2 humano o de ratón. Los valores de Bmax para los radioligandos se calcularon usando competencia homóloga. Los valores de IC50 para los péptidos competidores se calcularon con PRISM 7 (GraphPad), y los valores de Ki se calcularon con la corrección de Cheng-Prusoff48.

Los métodos para estos ensayos se han descrito previamente16. En resumen, para la unión de GTPγs, la potencia de los ligandos para estimular la elevación dependiente del receptor de la subunidad Gαs unida a GTPγS se determinó utilizando preparaciones de membrana de líneas celulares clonales de receptor de baja densidad. Las reacciones se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en placas de microtitulación blancas de fondo transparente, y el porcentaje de la respuesta máxima se calculó utilizando pocillos de control como referencia. Los valores relativos de EC50 se derivaron mediante análisis de regresión no lineal utilizando el porcentaje de respuesta frente a la concentración de ligando y se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros utilizando el software GraphPad Prism 7. Para los ensayos de AMPc, se realizaron ensayos de AMPc cinético en clones de células receptoras de baja densidad transfectadas con el vector Glosensor 22 F (Promega). Las células se equilibraron durante 5 a 20 minutos y luego se agregaron 20 μl de ligando 10x y se recolectó un curso de tiempo de luminiscencia. El ligando (10x) se tituló mediante dilución en serie manual en DMSO seguido de reducción gradual en tampón de ensayo.

Los detalles del protocolo general de perfusión se han descrito previamente11. En resumen, los islotes se seleccionaron individualmente para garantizar la consistencia entre las cámaras con respecto a la cantidad y el tamaño. Se cargó un total de 75 islotes en cámaras individuales y se perfundieron a una velocidad constante de 200 µl min–1 utilizando tampón de glucosa 2,7 mM Krebs-Ringer-fosfato-HEPES (KRPH) (NaCl 140 mM, KCl 4,7 mM, CaCl2 1,5 mM, NaH2PO4 1 mM, MgSO4 1 mM, NaHCO3 2 mM, HEPES 5 mM y BSA libre de FA al 0,1 % (pH 7,4)) con 100 l de medio Bio-Gel P-4 (Bio-Rad). El caudal se basó en la sugerencia del fabricante para este equipo. Los cambios en las concentraciones de glucosa se indican en las figuras y leyendas de las figuras. Los antagonistas se utilizaron en concentraciones de 1 μM, previamente establecidas para proporcionar un antagonismo completo. La concentración de tirzepatida se aumentó de 0 a 100 nM. Las concentraciones de insulina se expresan en función tanto de la velocidad como del número de islotes (ng ml–1 × (1/200 μl ml–1) × (1/75 islotes))49. El iAUC de la tirzepatida se calculó a partir de los minutos 42 a 80, usando el valor en el minuto 42 como referencia para cada muestra, y se expresa como una función del tiempo (ng/(islote × min) × min). Los valores de insulina se midieron con un inmunoensayo de insulina Lumit (Promega) utilizando un lector de placas EnVision (PerkinElmer).

Los islotes humanos se obtuvieron tanto del Alberta Diabetes Institute como del Integrated Islet Distribution Program. Todos los islotes se obtuvieron de donantes que dieron su consentimiento. Los detalles del protocolo de perfusión general se han descrito previamente21 y son similares al protocolo de perfusión de ratón. Para los experimentos de secreción de insulina (Fig. 2), el iAUC de la tirzepatida se calculó desde los minutos 42 a 65, utilizando el valor en el minuto 42 como referencia para cada muestra. Cada conjunto de islotes humanos constaba de n = 3 para cada condición. Estos se promediaron para generar un único punto de datos (Fig. 2c). Los valores de insulina se midieron con un inmunoensayo de insulina Lumit (Promega) utilizando un lector de placas EnVision (PerkinElmer). Para los experimentos de secreción de glucagón (Fig. 3), los valores promedio de glucagón se calcularon durante las condiciones de control (minutos 35 a 45) y estimuladas (minutos 55 a 65). Todos los péptidos se usaron en concentraciones de 30 nM según el trabajo previo16. Los aminoácidos se usaron en concentraciones de 3 mM según trabajos previos11. El glucagón se midió con un kit de inmunoensayo de glucagón Lumit (n.º de cat. CS3037A02; Promega) utilizando un lector de placas EnVision (PerkinElmer). La somatostatina se midió con un ensayo ELISA (cat. no. FEK-060-14; Phoenix Pharmaceuticals). Todos los datos se expresan como la concentración medida en relación con el caudal y el número de islotes (insulina, ng ml–1 × (1/200 µl ml–1) × (1/75 islotes); glucagón, pM × (1/200 µl ml–1) × (1/75 islotes); somatostatina, pg ml–1 × (1/200 µl ml–1) × (1/75 islotes))49. Los islotes pancreáticos humanos y el tejido pancreático se aislaron de donantes fallecidos con la aprobación ética de la Junta de ética de investigación humana de la Universidad de Alberta (Pro00013094, Pro00001754) y se obtuvieron del Programa integrado de distribución de islotes (IIDP) financiado por NIDDK (RRID: SCR _014387) . Todas las familias de los donantes dieron su consentimiento informado para el uso de tejido pancreático en la investigación y no recibieron compensación económica.

Los animales se mantuvieron en ayunas durante 5 h antes de la administración intraperitoneal de 1,5 g kg–1 de glucosa. Los antagonistas específicos se administraron 2 h antes que la glucosa en dosis de 1500 nmol kg–1, y la tirzepatida se administró 1 h antes que la glucosa, todo por inyección intraperitoneal. La glucosa se midió con un glucómetro portátil (Contour Blue, Bayer). La glucemia en ayunas se midió en el tiempo 0, 1 h después de la administración de glucosa. El AUC se calculó utilizando el valor de glucosa en ayunas para cada animal. Todos los ratones de tipo salvaje se adquirieron de Jackson Laboratories (n.º de cat. 000664) entre 8 y 12 semanas de edad. Todos los ratones knockout para Gipr de células beta se criaron internamente como se describió anteriormente10. Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke.

Todos los reactivos descritos aquí están disponibles para su distribución previa solicitud razonable al autor correspondiente.

Los tamaños de muestra para los experimentos con ratones y células se basaron en cálculos de potencia utilizando datos generados previamente con un protocolo experimental similar. Los experimentos con islotes humanos se realizaron en función de las capacidades del equipo y el diseño del experimento. Se realizó la prueba estadística apropiada y se indicó en el gráfico a continuación para cada experimento individual. Para ANOVA, se realizaron análisis post-hoc de Tukey para identificar diferencias específicas. Para todas las pruebas estadísticas, se utilizó un valor de P inferior a 0,05 para identificar valores estadísticamente diferentes. Las pruebas estadísticas específicas se indican en la Tabla de datos ampliados 3, y los resultados están disponibles para cada panel de datos en los archivos de datos sin procesar complementarios. Todos los valores presentados son medias ± sem

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos sin procesar se han proporcionado a la revista y están disponibles previa solicitud razonable a un autor correspondiente. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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KE fue apoyado por fondos del NIH NIDDK (K01 DK132461). MT fue apoyado por fondos de la subvención HypoFlam del Consejo Europeo de Investigación (ERC)-AdG (695054). TDM recibió el apoyo para este trabajo de la Fundación de Investigación Alemana (DFG TRR296, TRR152, SFB1123 y GRK 2816/1), el Centro Alemán para la Investigación de la Diabetes (DZD eV) y el ERC-CoG (101044445). JEC recibió el apoyo financiero de NIH NIDDK (R01 DK123075, DK125353 y DK046492), Helmsley Charitable Trust Foundation, subvenciones iniciadas por investigadores de Eli Lilly, Novo Nordisk y Proteostasis, y es becario de Borden. Damos las gracias a C. Stutsman y C. Corkins de asistencia técnica. También agradecemos a R. Samms, J. Moyers, M. Coghlan y R. Gimeno por su apoyo al proyecto y sus útiles debates sobre el manuscrito. Finalmente, agradecemos a los donantes por la capacidad de usar islotes humanos, y agradecemos a P. MacDonald del Alberta Diabetes Institute Islet Core, así como al Integrated Islet Distribution Program (IIDP) por proporcionar este recurso.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por Helmholtz Zentrum München - Centro Alemán de Investigación para la Salud Ambiental (GmbH).

Estos autores contribuyeron igualmente: Kimberley El, Jonathan D. Douros.

Instituto de Fisiología Molecular Duke, Durham, NC, EE. UU.

Kimberley El, Ashot Sargsyan, Alex Chen, Donald Wothe, David A. D'Alessio y Jonathan E. Campbell

Centro de Investigación Novo Nordic, Indianápolis, IN, EE. UU.

Jonathan D. Douros, Bin Yang y Brian Finan

Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Indianápolis, IN, EE. UU.

Francis S. Willard, David B. Wainscott y Kyle W. Sloop

Instituto de Diabetes y Obesidad, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Alemania

Aaron Novikoff, Callum Coupland y Timo D. Muller

Centro Alemán para la Investigación de la Diabetes (DZD), Neuherberg, Alemania

Aaron Novikoff, Callum Coupland y Timo D. Muller

Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad de Cincinnati, Cincinnati, OH, EE. UU.

Diego Perez-Tilve

Helmholtz Zentum München, Neuherberg, Alemania

Mattias H. Tschöp

Universidad Técnica de Munich, Munich, Alemania

Mattias H. Tschöp

División de Endocrinología, Departamento de Medicina, Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

David A. D'Alessio y Jonathan E. Campbell

Departamento de Farmacología y Biología del Cáncer, Universidad de Duke, Durham, NC, EE. UU.

jonathan e campbell

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JDD, TDM, KWS y JEC concibieron el estudio. KE, FSW, AN, AS, DPT, DBW, BY, AC, DW y CC realizaron la investigación. FWS, JDD, AN, TDM, FWS y JEC realizaron el análisis y la interpretación. JDD, DAD'A., TDM, KWS y JEC escribieron el borrador original. Todos los autores revisaron, editaron y aprobaron el manuscrito final. JDD, MHT, BF, DAD'A., KWS, TDM y JEC contribuyeron a financiar la adquisición y administración. JEC asume la responsabilidad principal de los datos descritos en este manuscrito.

Correspondencia a Kyle W. Sloop, Timo D. Müller o Jonathan E. Campbell.

El grupo Campbell recibe fondos para ciencia básica de Novo Nordisk y Eli Lilly. El grupo Müller recibe financiación para ciencia básica de Novo Nordisk. FSW, DBW y KWS son empleados de Eli Lilly. JDD, BY y BF son empleados de Novo Nordisk. DAD se ha desempeñado como consultor u orador en los últimos 12 meses para Eli Lilly y Structure Therapeutics. JEC se ha desempeñado como consultor u orador en los últimos 12 meses para Structure Therapeutics. Los restantes autores declaran no tener intereses contrapuestos ni conflicto de intereses.

Nature Metabolism agradece a Nigel Irwin y Stefan Offermanns por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Christoph Schmitt, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

A) Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) en ratones de tipo salvaje (WT). Los ratones se pretrataron 2 horas antes de la glucosa con PBS o un antagonista de GIPR, 1 hora antes de la glucosa con PBS o acil-GIP (dosis de 3 ó 10 nmol/kg). Se administró glucosa después de un ayuno de 5 horas a 1,5 mg/kg. El área integrada bajo la curva (iAUC) se calculó usando la medida de glucemia inmediatamente antes de la administración del antagonista de PBS/GIPR. dosis de 3 nmol/kg: PBS/PBS, n = 7; PBS/Acyl-GIP, n = 6, GIPR Antag/Acyl-GIP, n = 6. Dosis de 10 nmol/kg: PBS/PBS, n = 7; PBS/Acyl-GIP, n = 8, GIPR Antag/Acyl-GIP, n = 7. B) Una curva dosis-respuesta para tirzepatida durante un IPGTT en ratones WT. (n = 5/grupo) B) Tirzepatida durante un IPGTT en ratones knockout para WT y Glp1r. (n = 8/grupo) C) 30 nmol/kg de tirzepatida en ratones WT tratados con un antagonista de GLP-1R (Jant-4), GIPR o ambos. N = 8/grupo. Todos los valores son medios +/- SEM. Se utilizaron las siguientes pruebas estadísticas: A, B y D) ANOVA de una vía con la prueba posthoc de Tukey, C) ANOVA de dos vías con la prueba posthoc de Tukey.

Datos fuente

Se estimularon dos conjuntos de donantes independientes de islotes humanos con tirzepatida (TZP) 30 nM en presencia de concentraciones de 1 μM de exendina (9-39) (Ex9), hGIP (3-30) (GIPR Ant) o la combinación. El área integrada bajo la curva (iAUC) se calculó para la secreción de insulina estimulada por glucosa y tirzepatida usando el valor del primer punto de tiempo como referencia. Todos los valores son medias +/- SEM, n = 3/grupo. Se utilizó un ANOVA de una vía con la prueba posthoc de Tukey.

Datos fuente

Los islotes humanos se estimularon con tirzepatida o hGIP en presencia del antagonista de GIPR (GIPR Ant: panel izquierdo) o exendina (9-39) (Ex9: derecha). Se usó tirzepatida a 30 nM y los antagonistas se usaron a concentraciones de 1 µM. Todos los valores son medias +/- SEM, n = 3/grupo para antagonista de GIPR y 6/grupo para Ex9. Se utilizó un ANOVA de dos vías con la prueba posthoc de Tukey.

Datos fuente

Los islotes humanos se trataron con hGIP 30 nM o aminoácidos 3 mM (combinación de glutamina, arginina, alanina y leucina), individualmente o en combinación. Todos los valores son medias ± SEM, n = 3/grupo. Se utilizó un ANOVA de dos vías con la prueba posthoc de Tukey.

Datos fuente

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Reimpresiones y permisos

El, K., Douros, JD, Willard, FS et al. El coagonista de incretina tirzepatida requiere GIPR para la secreción de hormonas de los islotes humanos. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00811-0

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Recibido: 21 noviembre 2022

Aceptado: 21 de abril de 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00811-0

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