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Sep 10, 2023

Evolución intrahuésped secuencial y transmisión posterior del SARS

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3235 (2023) Citar este artículo

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Se han notificado infecciones persistentes por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) en personas inmunocomprometidas y personas que se someten a tratamientos inmunomoduladores. Aunque se ha documentado la evolución intrahuésped, faltan pruebas directas de transmisión subsiguiente y adaptación escalonada continua. Aquí describimos infecciones persistentes secuenciales por SARS-CoV-2 en tres individuos que condujeron a la aparición, transmisión directa y evolución continua de un nuevo sublinaje de Omicron, BA.1.23, durante un período de ocho meses. La variante BA.1.23 transmitida inicialmente codificaba siete sustituciones de aminoácidos adicionales dentro de la proteína de pico (E96D, R346T, L455W, K458M, A484V, H681R, A688V), y mostró una resistencia sustancial a la neutralización por sueros de BA.1 potenciado y/u Omicron. -Participantes del estudio infectados. La replicación continua posterior de BA.1.23 dio como resultado sustituciones adicionales en la proteína del pico (S254F, N448S, F456L, M458K, F981L, S982L), así como en otras cinco proteínas del virus. Nuestros hallazgos demuestran no solo que el linaje Omicron BA.1 puede divergir aún más de su genoma ya excepcionalmente mutado, sino también que los pacientes con infecciones persistentes pueden transmitir estas variantes virales. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de implementar estrategias para prevenir la replicación prolongada del SARS-CoV-2 y limitar la propagación de variantes emergentes resistentes a la neutralización en pacientes vulnerables.

El panorama genómico del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha sido moldeado por la aparición de variantes preocupantes antigénicamente diversas (COV)1. Estas variantes virales portan mutaciones que las hacen más transmisibles, más fusogénicas y/o permiten escapar no solo de la infección sino también de la inmunidad inducida por la vacuna2,3,4. Algunas variantes, como los COV de Omicron, que recorrieron el mundo a partir de noviembre de 2021, también muestran resistencia parcial o total a los tratamientos monoclonales terapéuticos o profilácticos5. Durante los últimos 14 meses, han seguido surgiendo sublinajes de Omicron con un número cada vez mayor de mutaciones en pico (p. ej., BA.2, BA.4/5, XBB.1, XBB.1.5), lo que plantea grandes desafíos para la contención del SARS- Propagación de CoV-2. Esto proporcionó la justificación para la formulación de vacunas de refuerzo bivalentes contra el SARS-CoV-2 que incluyen un pico Omicron BA.1 o BA.5 además del pico ancestral.

La mayoría de los pacientes con enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) eliminan el virus al resolverse la infección aguda. Sin embargo, se ha documentado la replicación continua del SARS-CoV-2 en un subconjunto de personas inmunodeprimidas. En estos casos de infección crónica, se ha observado la recuperación del virus infeccioso durante varios meses y la adquisición escalonada de mutaciones en la espiga, lo que apunta a una selección positiva6,7,8,9,10,11,12,13. Se ha especulado que la evolución viral intrahuésped prolongada desempeñó un papel en la aparición de varios COV del SARS-CoV-2 como Alpha y Omicron14,15, pero faltan pruebas claras de transmisiones directas de variantes mutadas de casos de infección crónica.

Describimos aquí un caso primario de infección persistente por SARS-CoV-2 Omicron BA.1 marcada por la evolución intrahuésped de una variante (Omicron BA.1.23) que codifica siete sustituciones de aminoácidos adicionales en la proteína de pico Omicron BA.1 ya antigénicamente distinta, y eso resultó en al menos cinco casos más de infección por Omicron BA.1.23. Las infecciones persistentes documentadas en dos de estos casos (una que duró cuatro semanas y la otra más de cuatro meses) se asociaron con la evolución continua de BA.1.23 y la adquisición de mutaciones adicionales dentro y fuera de la espiga. Aunque las variantes que evolucionaron en los casos persistentemente infectados durante el período acumulativo de ocho meses revelan constelaciones únicas de mutaciones en cada una, también apuntan fuertemente a una evolución viral convergente con otros linajes de SARS-CoV-2 cocirculantes. En particular, la mayoría de los cambios de aminoácidos ocurrieron en posiciones que se sabe que confieren escape inmunológico16,17 o fusogenicidad viral alterada18,19,20. Algunas de las mutaciones de escape en BA.1.23 también han surgido en linajes posteriores de Omicron, como BA.2.75.2. En general, nuestros resultados indican que la replicación viral persistente en el contexto de respuestas inmunitarias subóptimas es un importante impulsor de la diversificación del SARS-CoV-2.

Realizamos un análisis genómico de muestras nasofaríngeas (NP) y nasales anteriores (AN) recolectadas en serie de un paciente inmunocomprometido (P1) con linfoma difuso de células B y replicación persistente de SARS-CoV-2 Omicron BA.1 entre diciembre de 2021 y marzo de 2022. Durante un período de 12 semanas, documentamos la acumulación de nueve sustituciones de aminoácidos en el dominio N-terminal de la proteína espiga (NTD), el dominio de unión al receptor (RBD) y en el sitio de escisión de furina S1/S2 (FCS) (Fig. .1) dentro del mismo paciente. Las primeras cuatro mutaciones R346T, K458M, E484V y A688V se detectaron simultáneamente 40 días después del diagnóstico inicial de SARS-CoV-2 y se repararon. Dos semanas más tarde (día 64), se detectaron L167T y la mutación FCS P681Y además de las cuatro mutaciones iniciales. Durante las siguientes semanas surgieron mutaciones adicionales; las muestras de este período contenían mutaciones características compartidas (L455W) y distintas (E96D el día 72, S477D el día 81). En particular, solo surgieron dos mutaciones fuera del gen de la espiga (Fig. 1 complementaria, P1), lo que sugiere una selección positiva dentro del huésped de los cambios en la proteína de la espiga debido a las ventajas de replicación competitiva. La tasa de sustitución de SARS-CoV-2 varió a lo largo del curso de la infección; después de un período inicial de tres semanas sin cambios en la secuencia de consenso, hubo una rápida acumulación de sustituciones entre la semana 4 y la semana 12. En promedio, se observó una sustitución por semana durante este período, lo que corresponde a una tasa de 52 sustituciones/año – aproximadamente dos veces más que el promedio mundial de 26–27 sustituciones/año21,22.

Alineación de secuencias múltiples del gen de la espiga del SARS-CoV-2 que indica la aparición de variantes de un solo nucleótido (SNV) en la secuencia de consenso del gen de la espiga en muestras secuenciales obtenidas del caso índice (Paciente 1, P1). Los nuevos SNV relacionados con la cepa ancestral BA.1 se muestran en rojo y están etiquetados en la parte inferior de la figura. Las etiquetas en negrita indican mutaciones características observadas en múltiples especímenes. Los cambios de consenso en BA.1 en comparación con la cepa Wuhan-1 se muestran en azul.

La vigilancia genómica de antecedentes del SARS-CoV-2 en todo el sistema de salud realizada por el Programa de Vigilancia de Patógenos de Mount Sinai (MS-PSP) durante el mismo período identificó a otros tres pacientes que albergaban variantes de SARS-CoV-2 Omicron que compartían la misma combinación de amino de espiga sustituciones de ácido encontradas en el caso índice P1 (E96D, R346T, L455W, K458M, E484V, H681R, A688V), así como la mutación sinónima T6001C. Una consulta de más de 13,8 millones de secuencias globales de SARS-CoV-2 depositadas en la base de datos GISAID (Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data) hasta noviembre de 2022 reveló solo dos genomas relacionados adicionales, ambos originarios del área de Nueva York (Fig. 2, los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen). Según los metadatos proporcionados, estos dos genomas se obtuvieron de individuos distintos que diferían por edad y sexo de nuestros pacientes. En total, la presencia de la misma combinación única de mutaciones en cinco casos adicionales indica una transmisión directa local limitada de esta nueva subvariante de Omicron, que recibió la designación de linaje Pango BA.1.23 (Fig. 2, Tabla 1).

a Subárbol filogenético de máxima verosimilitud (ML) con secuencias de SARS-CoV-2 (BA.1) del caso de infección persistente P1 (rojo) y las transmisiones posteriores (P2, P3, P4 en cian, amarillo y verde respectivamente), en un fondo global de secuencias disponibles en GISAID. Las ramas están coloreadas para identificar a cada paciente. El número de días después de la primera muestra positiva de SARS-CoV-2 de P1 se indica entre paréntesis. Los clústeres hermanos están contraídos para facilitar la visualización. El eje x muestra el número de sustituciones de nucleótidos en relación con la raíz del árbol filogenético. Se muestran valores de soporte de Bootstrap superiores al 70 % para las ramas no colapsadas. La subvariante distinta de BA.1 que se transmitió se designó como linaje PANGO BA.1.23. El inserto inferior derecho muestra una filogenia de ML escalada en el tiempo y las estimaciones para el tiempo de los ancestros más recientes (TMRCA) y los intervalos de confianza del 95%, para los nodos donde se ubican las transmisiones del caso índice. b Frecuencia de variantes de un solo nucleótido (SNV) y sustituciones de aminoácidos para posiciones genómicas de SARS-CoV-2 con cambios de consenso de Wuhan-1 ancestral y Omicron BA.1. Las posiciones con nucleótidos mixtos por debajo de los niveles de consenso también se muestran para los SNV intrahost (miSNV) observados en más de un punto temporal. Los especímenes secuenciados se muestran secuencialmente para P1 con infección prolongada por BA.1 y casos de transmisión de BA.1.23 (P2, P3 y P4). Los genomas virales de P1 muestran una acumulación progresiva de mutaciones en el dominio N-terminal (NTD), el dominio de unión al receptor (RBD) y el sitio de escisión de furina S1/S2 (FCS); Posteriormente se detectó la misma constelación de mutaciones en tres casos de transmisión documentados (P2, P3 y P4). El número de días desde la primera prueba positiva en P1 se muestra a la izquierda, con el número de días después de la primera prueba positiva para cada paciente entre paréntesis. Las posiciones con SNV no sinónimos están marcadas con círculos rellenos. El tipo de muestra se indica a la derecha mediante círculos abiertos (narinas anteriores) o rombos rellenos (nasofaringe). Las posiciones se numeran de acuerdo con la secuencia del genoma de referencia NC_045512.2. Las flechas a la izquierda indican la ventana probable de transmisión del paciente índice entre los días 64 y 72. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Todos los casos de transmisión contenían un cambio sinónimo en ORF1a (T6001C) que anteriormente solo se observaba en el día 72 en el caso índice (Fig. 1 complementaria). Esto redujo la ventana de tiempo de la primera transmisión a un período de 18 días después del día 64, dos meses después de la primera prueba positiva de SARS-CoV-2 del paciente P1. Durante este tiempo, los pacientes P2 y P4 estuvieron ingresados ​​en la misma unidad que P1 durante 10 y 18 días, respectivamente. Luego de una transferencia, P4 también coincidió durante dos días con P3 en una unidad diferente. Si bien esto brindó una oportunidad potencial para el contacto directo o indirecto, es importante tener en cuenta que P3 y P4 no se analizaron para SARS-CoV-2 hasta tres semanas después, cuando se descubrió que dieron positivo. No se dispuso de información de contacto de los dos casos identificados fuera de nuestro sistema de salud. En febrero de 2023, el caso más reciente se detectó a mediados de abril de 2022 y la última muestra positiva de SARS-CoV-2 de un caso de transmisión directa (P3) se recolectó en septiembre de 2022. Aunque el aislamiento viral falló para las muestras disponibles de P1, cultivamos con éxito el SARS-CoV-2 de las muestras positivas iniciales de los casos posteriores (P2-P4), lo que confirma la transmisión del virus competente para la replicación.

Las tres transmisiones directas en nuestro sistema de salud se detectaron en pacientes con neoplasias malignas hematológicas subyacentes. Aunque el paciente P2 eliminó la infección BA.1.23, los pacientes P3 y P4 desarrollaron infecciones persistentes (Figs. 2 y 3a). El MS-PSP continuó monitoreando a estos pacientes durante las visitas de seguimiento y hospitalizaciones. El paciente P4 permaneció positivo en las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) durante cuatro semanas, con la adquisición de una mutación adicional en la espiga RBD (S:V445A) dentro de la semana posterior a la prueba positiva inicial (Figs. 2 y 3a). El paciente P3 desarrolló una infección persistente mucho más prolongada que duró más de cuatro meses. El análisis genómico de las 13 muestras recolectadas en serie del paciente P3 identificó varias sustituciones de aminoácidos nuevas en todo el genoma viral (Fig. 2b y Fig. 1 complementaria). El espécimen más divergente (es decir, el mayor número de mutaciones) recolectado 131 días después del inicio de COVID-19 del paciente P3 contenía 11 sustituciones de aminoácidos adicionales en comparación con la variante BA.1.23 transmitida originalmente. Estos incluyeron seis sustituciones en la espiga NTD (S254F), RBD (N448S, F456L, reversión de 458 M a K) y S2 (reversión de 981 L a F, S982L); así como cinco sustituciones en otras proteínas del SARS-CoV-2 (ORF1a nsp3: T1001/183I, K1795/977Q, ORF1ab nsp12: S4398/6 L, G5063/671 S; y ORF7a: T39I/T24I). En particular, dos reversiones de aminoácidos de punta a la secuencia Wuhan-1 (S: M458K) o BA.1 (S: F981L) estuvieron acompañadas de cambios en las posiciones vecinas (S: F456L y S: S982L) (Fig. 2b y Fig. Suplementaria . 1). Curiosamente, en las siguientes tres muestras de hisopos (días 144, 154 y 165), el número de sustituciones de aminoácidos disminuyó en relación con la muestra recolectada el día 131, con cambios y reversiones recurrentes entre las muestras, lo que sugiere la presencia de cuasiespecies competidoras.

a La línea de tiempo de la prueba de amplificación de ácido nucleico (NAAT) positiva (cruces rojas) o negativa (círculos azules abiertos) de pacientes infectados con BA.1.23 para SARS-CoV-2 (arriba). Se muestran los valores del umbral del ciclo objetivo (Ct) del gen N para muestras respiratorias, para diferentes métodos de diagnóstico (panel inferior). El panel NAAT solo incluye puntos de datos de pruebas positivas que informaron un valor de Ct. b Número de sustituciones de nucleótidos en la secuencia de consenso en relación con Omicron BA.1 en las muestras secuenciadas. c Niveles de anticuerpos IgG de unión a picos de SARS-CoV-2 para P1–P4. Los niveles de anticuerpos se muestran en unidades arbitrarias por ml (unidades arbitrarias/ml). Se indican las administraciones de vacunas documentadas. d Cronología de los tratamientos antivirales contra el SARS-CoV-2 recibidos por P1–P4. La duración del tratamiento está indicada por la longitud de la barra. Datos de origen proporcionados en el archivo de datos de origen.

Para investigar esto más a fondo, buscamos posiciones con variantes de nucleótido único intrahuésped (iSNV) que estuvieran presentes solo en una minoría de la población viral del SARS-CoV-2 dentro de cada espécimen (denominadas miSNV). Identificamos miSNV dentro o fuera del gen de la espiga en cada uno de los tres casos de infección persistente (P1, P3 y P4) con varios casos en los que miSNV estuvo presente en muestras anteriores, antes de su fijación en muestras posteriores del mismo paciente (Fig. .2b y las figuras complementarias 1, 2). También observamos numerosas posiciones con miSNV que persistieron en múltiples especímenes secuenciales sin llegar a ser dominantes. Esto fue más notable para el paciente P3, donde el número de posiciones con miSNV aumentó de 0 a 32 entre los días 101 y 266, superando en número a los cambios de secuencia de consenso por un factor de tres (Fig. 2b y Fig. 3 complementaria). Aproximadamente la mitad de estas mutaciones ocurrieron en el gen de la espiga, donde los miSNV no sinónimos se agruparon en S1 (NTD:S254F, RBD:K356T, S371F, P384L, F456L, K458M y FCS:N679K) y S2 (D936Y, V963F, N978D, L981F, S982L, E1195G) dominios (Fig. 2b y Fig. 4 complementaria). Las mutaciones en estas posiciones son raras en el nivel de consenso, con una prevalencia máxima del 0,1 % en la base de datos GISAID [al 2022-09-10]. Aunque no encontramos evidencia clara de compartimentación de miSNV por fuente de muestra entre pacientes, hubo una disminución notable en miSNV y un aumento en las mutaciones de consenso en la muestra AN recolectada del paciente P3 el día 131, en comparación con las muestras NP anteriores y posteriores. Por lo tanto, la adaptación intrahuésped ocurre con diferentes dinámicas que apuntan a cuellos de botella y presiones de selección en competencia, lo que resulta en la aparición y desaparición de mutaciones específicas.

Para examinar un papel potencial para la recombinación en la diversificación de BA.1.23, utilizamos RIPPLES23 para evaluar la ubicación filogenética de los segmentos del genoma de los genotipos de consenso más divergentes de BA.1.23 dentro de la diversidad global de SARS-CoV-2. Además, preguntamos si los patrones de miSNV observados estaban presentes en linajes contemporáneos usando covSPECTRUM24 y considerando todos los patrones en una ventana deslizante de 3 miSNV consecutivos. Ninguno de los análisis arrojó evidencia de recombinación, lo que brinda más apoyo para la diversificación a través de la acumulación de mutaciones durante la evolución intrahuésped.

Para determinar el impacto potencial de los tratamientos antivirales contra el SARS-CoV-2 en la evolución intrahuésped, examinamos los historiales de medicación de los pacientes P1 (índice), P2, P3 y P4 (Fig. 3, los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen). También evaluamos los niveles de anticuerpos de unión a picos de SARS-CoV-2 utilizando los datos serológicos disponibles de las pruebas clínicas. El paciente índice P1 fue vacunado en el momento del ingreso con dos dosis de una vacuna no especificada administrada seis meses y una semana antes de la hospitalización (Fig. 3c). Se administró una tercera dosis de vacuna dos días después del ingreso. Los tratamientos antivirales adicionales contra el SARS-CoV-2 incluyeron un ciclo de remdesivir los días 1 a 6 y una dosis de Gamunex IgG el día 9 (Fig. 3D). Se detectaron títulos moderados de anticuerpos de unión a pico de SARS-CoV-2 el día 38, aproximadamente cuando se encontraron las primeras mutaciones dentro del huésped (Figs. 2b y 3b). Estos títulos de anticuerpos podrían deberse a anticuerpos residuales del tratamiento con Gamunex IgG, una respuesta inmunitaria a la vacunación y/o infección, o una combinación de tratamiento y respuesta del huésped. En particular, la detección de las primeras tres mutaciones de pico siguió a un rápido aumento en el virus detectado en la secreción nasal (los umbrales medios del ciclo (Ct) de NAAT disminuyeron de 35 en el día 30 a 28 en el día 40), lo que sugiere un posible cuello de botella de selección en este momento ( Figuras 3a y 3c).

El paciente P2 recibió cuatro dosis de la vacuna Moderna mRNA, tres de ellas al menos cuatro meses antes de su primera prueba positiva de SARS-CoV-2 y tenía títulos altos de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 cuando se analizó tres meses antes de su única prueba positiva de SARS-CoV. -2 NAAT (Fig. 3c). Este paciente también recibió un curso de un mes de nirmatrelvir/ritonavir (Paxlovid™) (Fig. 3d). La combinación de altos niveles de anticuerpos IgG que se unen a picos y el tratamiento antiviral puede explicar por qué este paciente eliminó con éxito la infección BA.1.23.

El paciente P3 también fue vacunado con dos dosis de la vacuna de ARNm de Pfizer al menos cinco meses antes de su primera prueba positiva y recibió un ciclo de tres semanas de nirmatrelvir/ritonavir (Paxlovid™). Sin embargo, no se detectaron anticuerpos IgG de unión a picos de SARS-CoV-2 durante los primeros cuatro meses de la infección persistente (Fig. 3c). En particular, durante este tiempo tampoco detectamos nuevas sustituciones en el virus BA.1.23, a pesar de las indicaciones de replicación viral activa basadas en valores NAAT Ct consistentemente bajos (menos de 25) en muestras de NP y AN (Fig. 3a). La replicación activa de BA.1.23 se confirmó mediante el aislamiento de SARS-CoV-2 competente en replicación de cinco muestras recolectadas entre los días de estudio 101–147. La aparición de nuevas sustituciones intrahuésped durante el último mes de infección persistente ocurrió alrededor del momento de detección de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en niveles cercanos al límite de detección del ensayo serológico utilizado (COVID-SeroKlir, Kantaro Semi-Quantitative SARS- CoV-2 IgG; Fig. 3). Dado que el paciente P3 no recibió ningún producto biológico durante su hospitalización, es probable que la seroconversión observada fuera el resultado de una respuesta inmunitaria débil y retardada del huésped.

Para el paciente P4 no se registraron vacunas previas. Se administró bebtelovimab después de su primera prueba de PCR SARS-CoV-2 positiva, seguida de un ciclo de nirmatrelvir/ritonavir (PaxlovidTM). P4 tenía títulos bajos de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en el momento de la primera prueba de PCR positiva antes del tratamiento con anticuerpos monoclonales (Fig. 3c). Cabe destacar que en este paciente surgió una única mutación S:V445A. Las variantes virales que portan esta mutación se han asociado con una susceptibilidad reducida a bebtelovimab en ensayos de neutralización de partículas similares a virus (VLP) pseudotipadas25. No encontramos mutaciones del SARS-CoV-2 asociadas a remdesivir26,27,28,29,30,31 o resistencia a nirmatrelvir/ritonavir32 en ninguno de los pacientes tratados con estos fármacos.

La neutralización de aislados de Omicron BA.1 por sueros de individuos convalecientes o vacunados está fuertemente reducida en comparación con los niveles obtenidos para la neutralización de las cepas ancestrales33,34,35. Por lo tanto, evaluamos el grado de resistencia neutralizante de la variante BA.1.23 transmitida (BA.1 + S:E96D, R346T, L455W, K548M, E484V, P681R, A688V) en comparación con Omicron BA.1 (B.1.1.529) , así como el ancestral SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020, WA). Utilizamos un ensayo de microneutralización de varios ciclos en el que el suero humano está presente continuamente para imitar mejor las condiciones fisiológicas in vivo33,36. Seleccionamos sueros de dos subconjuntos de participantes del estudio PARIS que representan distintos niveles de inmunidad. El primer panel de sueros analizados se recolectó antes y después de la vacunación de refuerzo, mientras que el segundo conjunto de muestras se obtuvo antes y después de la infección por avance de Omicron BA.1 en los participantes vacunados (consulte la Tabla 1 complementaria para obtener detalles).

Los sueros recolectados antes de la vacunación de refuerzo con vacunas monovalentes de ARN de SARS-CoV-2 (18 muestras coincidentes), neutralizaron BA.1 y BA.1.23 menos que WA1/EE. UU. (título medio geométrico; GMT WA1: 71; GMT BA.1: 12; GMT BA.1.23: 6; Fig. 4a, los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen), y la mayoría de las muestras no mostraron ninguna actividad de neutralización contra BA.1 (5/9) y BA.1.23 (7 /9), respectivamente. Los sueros emparejados recolectados después de la vacunación de refuerzo con ARNm de los mismos participantes del estudio mostraron que la vacunación de refuerzo aumentó los títulos de neutralización para todos los aislados virales, pero la pérdida en la neutralización para BA.1.23 fue más de 12 veces en comparación con la reducción >6 veces para BA.1 en relación con WA1/USA (título medio geométrico; GMT WA1: 1689; BA.1: 189; GMT BA.1.23: 43; Fig. 4a). Es de destacar que la pérdida de actividad de neutralización para BA.1 en relación con la variante ancestral WA1/USA medida aquí es menor que lo que nosotros y otros hemos informado anteriormente, lo que podría deberse a la variación del ensayo en combinación con el número limitado de muestras analizadas33,34 ,37.

a Títulos de neutralización absolutos (izquierda) y veces de reducción (derecha) para las variantes WA−1, BA.1 y BA.1.23 por sueros pareados de 9 participantes del estudio recolectados antes y después de la vacunación de refuerzo (n = 18). El número de muestras con títulos por debajo del límite de detección del ensayo serológico (línea discontinua) se indica en la parte inferior del gráfico. Las barras de error representan la media geométrica con intervalos de confianza del 95%. Se usó un ANOVA de RM unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey para comparar los títulos de neutralización antes y después de la vacunación de refuerzo. ***valores p < 0,001, *valor p: 0,02. b Títulos de neutralización absoluta (izquierda) y veces de reducción (derecha) para aislamientos de WA-1, BA.1 y BA.1.23 por sueros de participantes del estudio que experimentaron una infección irruptiva con BA.1. Se muestran datos de sueros pareados de 11 participantes recolectados antes y después de la infección con BA.1 (n = 22). Las barras de error representan la media geométrica con intervalos de confianza del 95%. Se usó un ANOVA de RM unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey para comparar los títulos de neutralización antes y después de la infección por avance de BA.1. *valores p: 0,02, ns no significativo. c Títulos absolutos de neutralización para cada uno de los aislamientos (WA-1, BA.1 y BA.1.23) por sueros recolectados del paciente P2 antes y después de la infección con BA1.23. La primera línea punteada vertical (izquierda) representa el momento de la tercera dosis de vacuna en días en relación con el caso índice. La segunda línea de puntos vertical (derecha) indica el momento de la infección con la variante BA.1.23. d Comparación del cambio de veces de neutralización en la dilución inhibidora al 50 % (DI50) medido antes y después de la vacunación de refuerzo (panel izquierdo, basado en 4a), así como antes y después de BA.1 (panel central, basado en 4b) y BA.1.23 (panel derecho, paciente 2, basado en 4c) avance de la infección para cada uno de los tres virus probados (WA-1, BA.1 y BA.1.23). Cada punto representa IC50 o datos de cambio de veces para una muestra de suero específica analizada por dilución en serie en un entorno experimental de una sola réplica. GMT indica la media geométrica media de los valores de dilución inhibitoria al 50% (ID50). La línea punteada horizontal representa el límite de detección (10). A las muestras con títulos de neutralización por debajo del nivel de detección se les asignó el valor de neutralización de 5 (que equivale a la mitad del límite de detección) en las parcelas ID50. Los datos de origen para esta cifra se proporcionan en el archivo de datos de origen.

A continuación, probamos cómo los sueros recolectados de los mismos participantes del estudio antes y después de la infección avanzada con la variante BA.1 Omicron (22 muestras coincidentes) neutralizarían BA.1.23. Notamos una diferencia significativa en la actividad de neutralización para BA.1.23 y BA.1 en comparación con WA1 en las muestras recolectadas después de la infección por avance de BA.1 (Fig. 4b). Antes de la infección con BA.1, la diferencia era >17 veces con 3/11 muestras que tenían una actividad de neutralización indetectable para BA.1.23 y una diferencia >14 veces con 2/11 de las muestras que no neutralizaban BA.1 (GMT WA1: 346; GMT BA.1: 26; GMT BA.1.23: 22; Fig. 4b). Después de la infección, los títulos de neutralización aumentaron para los tres virus, reduciendo la diferencia a cuatro veces para BA.1 y cinco veces para BA.1.23 (GMT WA1: 1913; GMT BA.1: 503; GMT BA.1.23: 399; Fig. 4b).

Luego, analizamos los sueros recolectados del paciente P2 en diferentes puntos de tiempo (es decir, antes de la vacunación de refuerzo, después de la vacunación de refuerzo pero antes de la infección con BA.1.23 y en dos puntos de tiempo después de la infección con BA.1.23). P2 montó anticuerpos neutralizantes después de la vacunación de refuerzo con ARNm contra WA1, pero no contra BA.1 o BA.1.23 (Fig. 4c). El suero recolectado un mes después de la infección de avance con BA.1.23 mostró un fuerte aumento en la actividad de neutralización para BA.1 y BA.1.23. (Figura 4c). Por último, calculamos los cambios de pliegue para cada aislado viral antes y después de la vacunación de refuerzo o la infección de avance con BA.1 o BA.1.23 (Fig. 4d). Estos datos muestran que la vacunación de refuerzo monovalente aumenta los títulos de neutralización de las variantes ancestrales, mientras que las infecciones de avance con variantes de Omicron produjeron un impulso en la neutralización de estas variantes contemporáneas. Curiosamente, observamos una gran variación en la medida en que la infección BA.1 impulsó la neutralización de las dos variantes diferentes de Omicron (Fig. 4d, panel central, los cambios de pliegue varían de menos de 1 a más de 100 veces la diferencia).

En conclusión, el aislado BA.1.23 persistente transmitido es más resistente a la neutralización que el BA.1 parental. Sin embargo, la infección con la variante BA.1 o BA.1.23 de Omicron indujo respuestas humorales de reacción cruzada que fueron capaces de neutralizar ambas variantes.

Se ha especulado que la aparición de variantes de SARS-CoV-2 antigénicamente diversas, como Omicron, es el resultado de la evolución viral intrahuésped impulsada inicialmente por respuestas inmunitarias subóptimas y luego se propaga por transmisiones directas10. Nuestros datos demuestran que la evolución intrahuésped del SARS-CoV-2 durante la infección persistente en individuos inmunocomprometidos puede impulsar la aparición y propagación de nuevas (sub)variantes con mutaciones extensas en regiones antigénicas clave, incluso en el contexto del linaje Omicron ya altamente mutado. En particular, encontramos que la transmisión de virus persistentes puede ocurrir hasta dos meses después de la primera prueba positiva de SARS-CoV-2 (Fig. 2b). La evolución secuencial adicional en los casos de transmisión muestra que la divergencia rápida puede ocurrir paso a paso y persistir en un pequeño número de individuos, lo que complica la detección temprana de nuevas variantes.

Los cambios más extensos en la evolución del linaje BA.1.23 se observaron durante su aparición en el paciente P1 y su posterior divergencia en el paciente P3 durante un período total de 8 meses. Según los datos de las pruebas clínicas disponibles, ambos pacientes inicialmente dieron negativo para los anticuerpos contra el SARS-CoV-2, pero se seroconvirtieron a niveles moderados a bajos alrededor del tiempo en que se acumularon las mutaciones pico. Es probable que estas condiciones sean óptimas para la selección de mutaciones de escape inmunitario y proporcionen una explicación del agrupamiento de cambios específicos de BA.1.23 en la proteína espiga. Es importante tener en cuenta que los tratamientos antivirales administrados durante períodos de tiempo limitados como monoterapias (p. ej., anticuerpos monoclonales, remdesivir y nirmatrelvir/ritonavir (Paxlovid™)) no eliminaron la infección persistente, lo que destaca la necesidad de una terapia combinada mejorada o potencial adaptada para la eliminación viral en estas situaciones especiales.

Durante la aparición inicial del linaje BA.1.23 en el paciente índice P1, las mutaciones eran casi exclusivamente no sinónimas y se concentraban en la proteína espiga. Las sustituciones o posiciones de aminoácidos en las que se acumularon los cambios se han asociado con escape de neutralización (p. ej., R346T, E484V, S477)16,17, mayor avidez de unión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) (p. ej., R346T, L455W)38, mejora de la fusogenicidad (p. ej., P681R/Y)18, o un aumento previsto en la aptitud (p. ej., posiciones 346, 484 y 681)39. Los cambios graduales posteriores en el paciente P3 ocurrieron de manera más amplia en todo el genoma del SARS-CoV-2. Las mutaciones RBD N448S y F456L presentes en la muestra más reciente de P3 están dentro de la región de unión de ACE2 con el potencial de cambios en la afinidad de unión y el escape de anticuerpos38. Las mutaciones fuera de la espiga asignadas a proteínas no estructurales, muchas de las cuales se han detectado previamente en otros VOC como Nsp3:T183I (Alpha), Nsp3:K977Q (Gamma), Nsp12:G671S (Delta AY.*) y Omicron (BA.2.75 ). Aunque los efectos de estas mutaciones no han sido caracterizados, ocurrieron en la subunidad de la polimerasa del virus (Nsp12) y en proteínas con actividad antagonista hacia la inmunidad innata del huésped (Nsp3, ORF6, ORF7a, ORF9b)40.

De acuerdo con los cambios extensos en la proteína de pico, la resistencia de la variante BA.1.23 transmitida a la neutralización por sueros policlonales aumentó sustancialmente en comparación con la cepa ancestral SARS-CoV-2, así como con BA.1 Omicron. Esto fue cierto tanto para los sueros recogidos antes como después de la vacunación de refuerzo monovalente, así como para la infección por avance de BA.1 (Fig. 4). El escape de la neutralización probablemente estuvo mediado por la combinación de R346T, L455W, K458M y E/A484V dentro de la región de unión del receptor de la espiga. Cabe destacar que las sustituciones en la posición R346 se encuentran en varios sublinajes de Omicron (p. ej., BA.4, BA.5) y subvariantes (p. ej., BA.2.72.2, BA.4.6/BF.7 (R346T), BA.4.7 ( R346S) y BA.5.9 (R346I))41. Estas variantes no circulaban en el momento de la aparición de BA.1.23, lo que apunta a una evolución convergente en el contexto de respuestas inmunitarias subóptimas.

Además, encontramos que los cambios en las poblaciones virales minoritarias pueden aumentar en gran medida el espectro de mutaciones durante la infección persistente más allá de lo que se observa en el nivel de consenso. Se han descrito 'cuasi-especies' virales para coronavirus pandémicos como el SARS-CoV-1, el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) y el SARS-CoV-242,43,44,45,46,47,48, pero su papel queda por dilucidar completamente49. Curiosamente, los miSNV se produjeron predominantemente en regiones conservadas y permanecieron presentes en múltiples especímenes secuenciales. Solo un pequeño subconjunto de estas mutaciones se volvió dominante en especímenes posteriores. Especulamos que estas poblaciones virales permiten que las mutaciones subóptimas persistan dentro del huésped, lo que aumenta la probabilidad de que surjan mutaciones compensatorias que compensen sus defectos de aptitud.

A pesar de un seguimiento cuidadoso, no encontramos nuevos casos de BA.1.23 en nuestra vigilancia rutinaria de SARS-CoV-2 o en la base de datos GISAID entre junio y septiembre de 2022, lo que sugiere que el linaje no se ha propagado más allá del brote inicial. Esto puede deberse a una mayor precaución por parte de los pacientes inmunocomprometidos para evitar contactos que puedan aumentar su riesgo de infección. También observamos que los pacientes P1, P3 y P4 fueron hospitalizados durante largos períodos de tiempo durante sus infecciones persistentes, lo que limita aún más la exposición comunitaria. Finalmente, la transmisión limitada podría reflejar una aptitud reducida de BA.1.23 en comparación con los linajes contemporáneos. Cabe destacar a este respecto que el surgimiento del linaje BA.1.23 coincidió con el desplazamiento general de BA.1 por los sublinajes BA.2 en el área de Nueva York, en particular BA.2.12.1, que dominó los casos de SARS-CoV-2 durante la primavera y principios del verano de 2022. Se necesitará un período de observación más largo con vigilancia continua de antecedentes para identificar rápidamente cualquier resurgimiento potencial de BA.1.23 en pacientes que no sean los incluidos en este estudio.

Nuestros hallazgos se suman al conocimiento acumulado sobre las infecciones persistentes por SARS-CoV-2 y documentan las transmisiones hacia adelante posteriores. Además, mostramos que las infecciones persistentes pueden impulsar la aparición de variantes virales con el potencial de propagarse a otras personas, algunas de las cuales pueden desarrollar infecciones prolongadas y, por lo tanto, establecer una vía para la evolución continua del virus. Esto justifica el seguimiento genómico de las infecciones persistentes en particular y subraya aún más la necesidad de limitar la duración de la infección viral. La detección temprana mejorada de nuevas variantes del SARS-CoV-2 y el seguimiento de la transmisión directa, una mejor comprensión de los procesos de selección que impulsan la evolución del SARS-CoV-2 y el papel de los miSNV, así como las terapias que limitan la persistencia y la propagación del virus, son esenciales para reducir la aparición de variantes virales altamente mutadas en el futuro.

Las pruebas de diagnóstico molecular de SARS-CoV-2 se realizaron en los Laboratorios de Microbiología Molecular del Laboratorio Clínico de MSHS mediante pruebas de amplificación de ácido nucleico (NAAT) que han sido validadas para muestras nasofaríngeas (NP), nasales anteriores (AN) y de saliva. Todas las muestras positivas incluidas en este estudio, excepto una, se analizaron con el kit de detección de ácido nucleico del nuevo coronavirus PerkinElmer®, que proporciona una detección cualitativa del ácido nucleico del SARS-CoV-2. Incluye dos objetivos SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) y un control positivo interno (IC; bacteriófago MS2). Los valores de umbral de ciclo (Ct) se generan para los tres objetivos y proporcionan una estimación cuantitativa de la carga viral. La única otra muestra positiva que se ejecutó en otra plataforma de prueba fue la primera muestra del caso índice (P1). Se probó como una prueba de punto de atención (POC) utilizando el ensayo cobas® Liat® System (cobas® SARS-CoV-2 & Influenza A/B), y la muestra biológica se descartó antes de transferirla al MS-PSP.

El Programa de vigilancia de patógenos de Mount Sinai (MS-PSP) ha perfilado el panorama en evolución del SARS-CoV-2 en la ciudad de Nueva York (NYC) desde el comienzo de la pandemia50,51. Realizamos rutinariamente la secuenciación completa del genoma viral de muestras positivas para SARS-CoV-2 contemporáneas seleccionadas al azar recolectadas de pacientes que buscan atención en nuestro sistema de salud. Se recolectaron muestras respiratorias residuales (hisopos NP, AN) después de completar el proceso de diagnóstico, como parte del Programa de Vigilancia de Patógenos de Mount Sinai.

Utilizamos un panel de sueros recolectados como parte de la cohorte observacional longitudinal PARIS (Protección Asociada con Inmunidad Rápida al SARS-CoV-2)52. Este estudio sigue longitudinalmente a los trabajadores de la salud desde abril de 2020. Las muestras se seleccionaron en función de los diferentes niveles de inmunidad de los participantes del estudio (antes y después de la vacunación de refuerzo, así como antes y después de la infección por Omicron BA.1). Los sueros recolectados antes y después de la vacunación de refuerzo contra el SARS-CoV-2 (n = 9 participantes, 18 sueros), así como antes y después de las infecciones emergentes con Omicron BA.1 (n = 11 participantes, 22 sueros), se seleccionaron para la prueba. en este estudio (consulte las Tablas complementarias 1 y 2 para obtener información sobre infecciones, vacunas y datos demográficos). Varias muestras de suero del paciente P2 antes y después de la infección BA.1.23 estaban disponibles para ensayos de neutralización. Los 44 sueros (40 PARIS, 4 de P2) de nuestras cohortes de observación son exclusivos de este estudio y no están disponibles públicamente.

El programa fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Mount Sinai (MSH) (IRB-13-00981). La investigación detallada sobre las infecciones persistentes por SARS-CoV-2 en pacientes que reciben atención en el Sistema de Salud Mount Sinai fue revisada y aprobada por separado por el MSH IRB (IRB-22-00760). El estudio PARIS fue revisado y aprobado por MSH IRB (IRB-20-03374). Todos los participantes firmaron formularios de consentimiento por escrito antes de la recolección de muestras y datos y dieron permiso para almacenar y compartir muestras. Además, el paciente P2 participó en otro de nuestros estudios observacionales (IRB-16-01215). Ellos dieron su consentimiento por escrito antes de la recolección de muestras biológicas y datos.

El ARN se extrajo utilizando el Chemagic ™ Viral DNA/RNA 300 Kit H96 (PerkinElmer, CMG-1033-S) en el instrumento automatizado Chemagic ™ 360 (PerkinElmer, 2024-0020) a partir de 300 ul de medio de transporte viral según el protocolo del fabricante. La síntesis de ADNc seguida de la amplificación del genoma completo con dos conjuntos de paneles de cebadores personalizados dirigidos a regiones de 1,5 y 2 kb en todo el genoma del SARS-CoV-2 se realizó como se describió anteriormente50 con la adición de nuevos oligonucleótidos para minimizar la pérdida de amplicón para los linajes Omicron derivados del linaje B de PANGO .1.1.529 (Tabla complementaria 3). Las bibliotecas Nextera XT (Illumina, cat. FC-131-1096) de extremos emparejados (2x150 pb) preparadas a partir de amplicones se secuenciaron en un instrumento MiSeq. Los genomas del SARS-CoV-2 se ensamblaron utilizando nuestra herramienta personalizada de IDentificación y canalización de ensamblaje basada en referencia de virus (vRAPID)53 con modificaciones de nuestra canalización de ensamblaje covid descrita anteriormente50. La profundidad de secuenciación promedio final por genoma osciló entre ~ 135k y ~ 415k lecturas.

Las variantes minoritarias de nucleótido único intrahuésped (miSNV) se anotaron cuando estaban presentes en las lecturas de cadena directa e inversa de una sola muestra y con una frecuencia mínima de 0,1 (10 %). Se aplicó un segundo filtro de control de calidad al incluir solo las posiciones en las que miSNV estaba presente en más de una muestra del estudio (de diferentes puntos de tiempo) o para las posiciones que cambiaron en el nivel de consenso en cualquier punto de la investigación.

Las secuencias de fondo global del SARS-CoV-2 se descargaron de la base de datos GISAID EpiCoV (al 2022-11-07). Se consultó la base de datos GISAID para las nuevas mutaciones observadas en las secuencias P1-P4 para identificar sus coincidencias más cercanas. Los aciertos de secuencia fueron confirmados por su distancia Mash54. Para ello se generó un boceto del genoma con Mash v.2.3 a partir del alineamiento sanitizado de las secuencias globales filtradas para linajes BA.1.* como las produce Nextstrain1,55 v11 para SARS-CoV-2 con parámetros por defecto (https:// github.com/nexttrain/ncov). Esto permitió comparaciones por pares de nuestros datos con secuencias globales de alta calidad con metadatos disponibles. Las inferencias filogenéticas de máxima probabilidad de los genomas MS-PSP SARS-CoV-2, incluidas las coincidencias de secuencia más cercanas y todas las demás secuencias de linaje BA.* del programa de vigilancia MS-PSP, se realizaron utilizando un Omicron BA.* y un New York State -focused background con esquema de submuestreo de proximidad con Nextstrain bajo el modelo GTR+G de sustitución de nucleótidos. El soporte de sucursales se evaluó con el método de arranque ultrarrápido con 1000 repeticiones en IQ-TREE multinúcleo versión 2.1.256,57. Las asignaciones de clado y linaje se realizaron con Nextclade CLI v3.2 (2021-11-04)58 y con PANGO-v1.8 (pangolin v3.1.17, pangoLEARN v.2022-04-22)59,60.

Realizamos un análisis de recombinación para el linaje BA.1.23 en el nivel de consenso con RIPPLES (Recombination Inference using Phylogenetic PLAcEmentS23), con parámetros predeterminados pero que permiten un mínimo de 3 descendientes. Este análisis se realizó utilizando una filogenia a escala global generada con UShER61 que contiene una extensa colección de secuencias públicas de Genebank, COG-UK y el Centro Nacional de Bioinformación de China (http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/wuhCor1/UShER_SARS -CoV-2/). Se consideró que las mejoras en la puntuación de parsimonia por encima de 7 reflejaban verdaderos eventos de recombinación.

Para tener en cuenta las variantes presentes por debajo de los niveles de consenso, consideramos todas las muestras del paciente P1 desde el día 46, cuando se detectaron variantes minoritarias en más de 10 posiciones, hasta el día 131, cuando se observó el mayor número de mutaciones. Utilizamos una ventana deslizante de 3 mutaciones consecutivas para identificar linajes que portaban combinaciones similares en covSPECTRUM24. Los criterios de búsqueda incluyeron la diversidad global (filtro mundial) entre el período de 2021-11-01 (aparición de Omicron) y 2022-09-30 (10 días después de que se identificara la última muestra BA.1.23).

El SARS-CoV-2 con capacidad de replicación se obtuvo como se describió anteriormente33. Brevemente, las células Vero-E6 que expresan la serina proteasa 2 transmembrana (TMPRSS2) (BPS Biosciences, catálogo (cat.) no. 78081) y las células Vero-E6 que expresan tanto TMPRSS2 como la enzima convertidora de angiotensina-2 (ACE2) (BEI Resources, catálogo ( cat.) n.º NR-54970) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco que contenía un 10 % de suero bovino fetal inactivado por calor y un 1 % de solución de aminoácidos del medio mínimo esencial (MEM), complementado con 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml estreptomicina, normocina 100 μg/ml y puromicina 3 μg/ml. Las líneas celulares fueron autenticadas por el proveedor y se determinó que estaban libres de contaminación por Mycoplasma mediante un ensayo basado en PCR (Universal Mycoplasma Detection Kit, ATCC, Cat. 30-1012 K). Se agregaron 200 ul de medio de transporte viral de la muestra de hisopo nasofaríngeo o de las fosas nasales anteriores a células Vero-E6-TMPRSS2 o Vero-E6-TMPRSS2.T2A.ACE2 en medios de cultivo suplementados con suero bovino fetal inactivado por calor al 2%, 100 g/ ml de normocina y 0,5 µg/ml de anfotericina B. Los cultivos se mantuvieron durante un máximo de 10 días. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron y clarificaron por centrifugación (3739 g durante 5 min) tras la aparición de efectos citopáticos. Los cultivos virales fueron exitosos para las muestras iniciales obtenidas de los pacientes P2, P3 y P4, pero fallaron para todas las muestras de los pacientes P1. Dos aislamientos representativos y secuenciados verificados de BA.1.23 se depositaron en los recursos BEI de los NIH.

Los stocks virales se verificaron en secuencia y luego se titularon utilizando el método de dosis infecciosa de cultivo de tejido al 50 % (TCID50) en células Vero-E6-TMPRSS2. Sobre la base de la verificación de la secuenciación, se seleccionó un aislado viral de P3 (PV56567) para experimentos adicionales. Dado que el título viral inicial del BA.1 expandido. 23 El stock viral de PV56567 era demasiado bajo (4 × 10 ^ 2 TCID50/ml) para realizar ensayos de microneutralización, concentramos el aislado viral 4x usando las columnas Pierce™ Protein Concentrator PES, 100 K MWCO (Thermo Scientific, número de catálogo: 88537) como se describe por el fabricante. Brevemente, el sobrenadante del cultivo se recogió tras la aparición de un efecto citopático (CPE), se aclaró mediante centrifugación (3739 g, 5 min) y luego se concentró. Los títulos después de la concentración fueron 2,25 × 10 ^ 5 TCID50/ml.

Los sueros recolectados de tres grupos diferentes de participantes del estudio se usaron para evaluar la neutralización de los aislamientos de SARS-CoV-2 de tipo salvaje (WA1), BA.1 y BA.1.23. El primer panel de muestras incluye sueros recolectados antes y después de la vacunación de refuerzo con mRNA SARS-CoV-2 (n = 9, cohorte de PARIS), el segundo panel incluye sueros recolectados antes y después de la infección por brote de BA.1 Omicron (n = 11, cohorte de PARÍS). La última serie incluye muestras longitudinales de P2, el primero de los casos de transmisión directa, recolectadas antes y después de la infección con BA.1.23.

Los sueros de los participantes del estudio se diluyeron en serie (tres veces) a partir de una dilución inicial de 1:10 usando medios de infección que consistían en medios esenciales mínimos (MEM, Gibco) suplementados con L-glutamina 2 mM, bicarbonato de sodio al 0,1 % (p/v, Gibco), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico 10 mM (HEPES, Gibco), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 μg/ml (Gibco) y albúmina sérica bovina al 0,2 % (MP Biomedicals). Los sueros diluidos se incubaron durante una hora con 10.000 TCID50 de los tres virus diferentes a temperatura ambiente. Después de la incubación, se transfirieron 120 μl de la mezcla de virus y suero a Vero-E6-TMPRSS2 (placas de 96 pocillos el día anterior) y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante una hora. Se eliminó la mezcla de suero-virus y se añadieron 100 μl/pocillo de los sueros diluidos además de 100 μl/pocillo de MEM 2% FBS. Las placas se incubaron durante 48 h a 37 °C de incubación. Las células se fijaron (200 μl/pocillo, solución de formaldehído al 10 %) durante la noche a 4 °C antes de teñirlas con el anticuerpo monoclonal de nucleoproteína del SARS biotinilado 1C7C7 (Millipore Sigma, n.° de cat. ZMS1075) a una concentración de 1 μg ml−1, seguido de una tinción secundaria con estreptavidina conjugada con HRP (Thermo Fisher Scientific) a una dilución de 1:2000 como se describió anteriormente33. Todos los procedimientos anteriores se realizaron dos veces en las instalaciones de Bioseguridad Nivel 3 (BSL-3) en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai siguiendo las pautas de seguridad estándar aprobadas. La tinción de nucleoproteínas se realizó como se describió previamente33. Todos los anticuerpos comerciales fueron validados por sus fabricantes y valorados en el laboratorio para determinar la concentración óptima para la experimentación. El anticuerpo monoclonal 1C7C7 biotinilado interno se validó en células infectadas con aislados virales WT SARS-CoV-2, BA.1 y BA.1.23.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism 9 (GraphPad). Se usó un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para comparar los títulos de neutralización para los tres virus.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las secuencias genómicas completas de los aislados virales cultivados a partir de hisopos nasales (BA.1 y BA.1.23) están disponibles en GenBank (números de acceso ON220548, ON220539, ON196014, ON193425, ON220529, ON220571, ON220533, ON934538, ON934577, ON934030, ON9 34607, EN854465 , ON619382). Los datos de RNA-seq están disponibles en Sequence Read Archive (SRA), presentación SUB12865927 con el número de BioProject PRJNA623586 (números de acceso de BioSample SAMN33273632 - SAMN33273655). Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual se adjuntan como datos complementarios. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

La canalización de vRAPID se desarrolló para el ensamblaje del genoma viral basado en referencias de datos de secuenciación de lectura corta. El código personalizado está en vRAPID [https://zenodo.org/record/7829342].

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Agradecemos al liderazgo escolar y del Hospital Mount Sinai, en particular al Dr. David Reich, al Dr. Dennis Charney y al Dr. Carlos Cordon-Cardo, por su continuo apoyo a la MS-PSP durante la pandemia. Agradecemos a los tecnólogos de laboratorio y al personal de los Laboratorios de Microbiología Molecular y los Laboratorios de Respuesta Rápida del Sistema de Salud Mount Sinai ya que sin su asistencia y ayuda, nada de este trabajo de vigilancia sería posible. Agradecemos al Dr. RA Albrecht por la supervisión de la instalación de biocontención BSL-3 convencional en Mount Sinai, lo que hace posible nuestro trabajo con aislamientos de SARS-CoV-2 competentes para la replicación. Agradecemos a los autores y a los laboratorios de origen y envío de secuencias de EpiCoV de GISAID (www.gisaid.org) que se utilizaron como base para nuestras inferencias filogenéticas. El trabajo informado fue, en parte, respaldado por un contrato del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (75N93021C00014, Opción 12 A, a VS y HvB) otorgado al Centro de Investigación sobre Patogénesis y Transmisión de la Influenza y por una Opción a la Contrato 75N93019C00051 (para FK y VS) de los Centros Colaborativos de Innovación en Vacunas contra la Influenza (CIVIC) como parte del Programa de Evaluación de la Evolución Viral (SAVE) del SARS-CoV-2, un contrato del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (HHSN272201400008C, Opción 20 , a VS, FK y HvB) otorgado al Centro de Investigación sobre Patogénesis de la Influenza, y premios (S10OD026880 y S10OD030463, a ISMMS) de la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH. R21AI169280 (a VS) y U19AI168631 (a VS, FK y HvB) proporcionaron soporte adicional. El Programa de Vigilancia de Patógenos de Mount Sinai está financiado en parte por fondos institucionales de la Facultad de Medicina de Icahn y del Hospital Mount Sinai (para EMS, VS y HvB). Este trabajo también fue respaldado en parte a través de los recursos computacionales y de datos y la experiencia del personal proporcionado por Scientific Computing and Data en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai y respaldado por la subvención UL1TR004419 de Clinical and Translational Science Awards (CTSA) del National Center for Avance de las Ciencias Traslacionales (a la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai).

Departamento de Genética y Ciencias Genómicas, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Ana S. Gonzalez-Reiche, Daniel Floda, Adriana van de Guchte, Zain Khalil, Keith Farrugia, Jian Zhang, Bremy Alburquerque, Robert Sebra & Harm van Bakel

Departamento de Microbiología, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Hala Alshammary, Jose Polanco, Juan Manuel Carreño, Angela A. Amoako, Aria Rooker, Christian Cognigni, Giulio Kleiner, Dalles Andre, Katherine F. Beach, Maria C. Bermudez-Gonzalez, Gianna Cai, Neko Lyttle, Lubbertus CF Mulder, Annika Oostenink, Ashley Beathrese T. Salimbangon, Gagandeep Singh, Morgan van Kesteren, Brian Monahan, Jacob Mauldin, Levy A. Sominsky, Charles Gleason, Komal Srivastava, Florian Krammer, Viviana Simon y Harm van Bakel

Centro de Investigación de Vacunas y Preparación para Pandemias (C-VaRPP), Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Hala Alshammary, Jose Polanco, Juan Manuel Carreño, Angela A. Amoako, Aria Rooker, Christian Cognigni, Levy A. Sominsky, Charles Gleason, Komal Srivastava, Florian Krammer & Viviana Simon

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Sarah Schaefer, Gopi Patel y Viviana Simón

Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Nima Assad & Bremy Alburquerque

Instituto de Genómica Icahn, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Robert Sebra y Harm van Bakel

Instituto de Células Madre de la Familia Negra, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Roberto Sebra

Instituto de Salud Global y Patógenos Emergentes, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Roberto Sebra

Departamento de Patología, Medicina Molecular y Basada en Células, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

John David Ramirez, Radhika Banu, Paras Shrestha, Florian Krammer, Alberto Paniz-Mondolfi, Emilia Mia Sordillo & Viviana Simon

Centro de Investigaciones en Microbiología y Biotecnología-UR (CIMBIUR), Facultad de Ciencias Naturales, Universidad del Rosario, Bogotá, Colombia

Juan David Ramirez

Instituto de Patógenos Emergentes de Salud Global, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Viviana Simon

Medicina Ambiental y Salud Pública, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, 10029, EE. UU.

Mahmud Awawda

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Conceptualización: ASG-R., HA, EMS, VS, HvB Adquisición de muestras: SS, GP, JP, AA, AR, CC, DF, LAS, CG, KS, JDR, RB, PS, AP-M., PSP- Grupo de Estudio de PARÍS. Secuenciación y ensamblaje del genoma: A.vd.G., KF, ZK, JZ, BA, RS Metodología: ASG-R., HA, NA, JMC, FK Investigación: ASG-R., HA, JMC, EMS, VS, HvB Visualización: ASG-R., HA, VS, HvB Financiamiento Adquisición: EMS, VS, HvB Administración de proyectos: KS, EMS, VS, HvB Supervisión: EMS, VS, HvB Redacción – Primer borrador: ASG-R., HA, Redacción HvB – Revisión y edición: ASG-R., HA, JMC, FKEMS, VS, HvB

Correspondence to Emilia Mia Sordillo, Viviana Simon or Harm van Bakel.

La Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai ha presentado solicitudes de patente relacionadas con los ensayos serológicos de SARS-CoV-2 (Números de solicitud provisional de EE. -2 vacunas (Número de solicitud provisional de EE. UU.: 63/251,020) que incluyen a Florian Krammer como co-inventor. Viviana Simon también figura en la solicitud de patente de ensayo serológico como coinventora. Las solicitudes de patentes fueron presentadas por la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Mount Sinai ha creado una empresa, Kantaro, para comercializar pruebas serológicas para el SARS-CoV-2. Florian Krammer ha sido consultor de Merck y Pfizer (antes de 2020) y actualmente es consultor de Pfizer, Third Rock Ventures, Seqirus y Avimex. El laboratorio Krammer también está colaborando con Pfizer en modelos animales de SARS-CoV-2. Robert Sebra es actualmente un consultor pagado y accionista de GeneDx.

Nature Communications agradece a Stephanie Longet y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

González-Reiche, AS, Alshammary, H., Schaefer, S. et al. Evolución intrahost secuencial y transmisión posterior de variantes de SARS-CoV-2. Nat Comun 14, 3235 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38867-x

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Recibido: 07 Octubre 2022

Aceptado: 16 mayo 2023

Publicado: 03 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38867-x

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