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Aug 23, 2023

El impacto de la suplementación con vitamina D3 en el microbioma fecal y oral de los terneros lecheros en el interior o en el pasto

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9111 (2023) Citar este artículo

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La vitamina D (VitD) está emergiendo como un regulador inmunológico además de su papel establecido en el metabolismo y la homeostasis mineral. Este estudio buscó determinar si VitD in vivo moduló el microbioma oral y fecal en terneros lecheros Holstein-Friesian. El modelo experimental consistió en dos grupos de control (Ctl-In, Ctl-Out) que fueron alimentados con una dieta que contenía 6000 UI/Kg de VitD3 en sustituto de leche y 2000 UI/Kg en el alimento, y dos grupos de tratamiento (VitD-In, VitD-Out) con 10.000 UI/Kg de VitD3 en sustituto de leche y 4000 UI/Kg en pienso. Un grupo de control y otro de tratamiento se trasladaron al aire libre después del destete aproximadamente a las 10 semanas de edad. Las muestras de saliva y heces se recolectaron después de 7 meses de suplementación y el análisis del microbioma se realizó mediante secuenciación de ARNr 16S. El análisis de disimilitud de Bray-Curtis identificó que tanto el sitio de muestreo (oral frente a fecal) como el alojamiento (interior frente a exterior) tenían influencias significativas en la composición del microbioma. Los terneros alojados al aire libre tenían una mayor diversidad microbiana en las muestras fecales según las medidas de Observed, Chao1, Shannon, Simpson y Fisher en comparación con los terneros alojados en el interior (P < 0,05). Se observó una interacción significativa entre alojamiento y tratamiento para los géneros Oscillospira, Ruminococcus, CF231 y Paludibacter en muestras fecales. Los géneros Oscillospira y Dorea aumentaron mientras que Clostridium y Blautia disminuyeron luego de la suplementación con VitD en las muestras fecales (P < 0.05). Se detectó una interacción entre la suplementación con VitD y el alojamiento en la abundancia de los géneros Actinobacillus y Streptococcus en las muestras orales. La suplementación con VitD aumentó los géneros Oscillospira, Helcococcus y redujo los géneros Actinobacillus, Ruminococcus, Moraxella, Clostridium, Prevotella, Succinivibrio y Parvimonas. Estos datos preliminares sugieren que la suplementación con VitD altera tanto el microbioma oral como el fecal. Ahora se llevarán a cabo más investigaciones para establecer la importancia de las alteraciones microbianas para la salud y el rendimiento animal.

Las enfermedades infecciosas tienen un impacto significativo en la sostenibilidad económica de los sistemas lecheros, y la mortalidad anual temprana puede representar casi el 10 % de los terneros en promedio, con tasas significativamente más altas en algunas empresas agrícolas1. Además, la enfermedad compromete la capacidad de los terneros adicionales para cumplir con los objetivos de producción y alcanzar su potencial genético. Las bacterias y los virus respiratorios y entéricos (virus respiratorio sincitial, BVD, herpesvirus, E. coli, rotavirus, Salmonella) representan la mayoría de las enfermedades infecciosas que afectan a los terneros lecheros jóvenes2,3. Un comienzo de vida desadaptativo puede continuar comprometiendo la productividad del ganado y contribuir a la susceptibilidad a enfermedades más adelante en la vida2. Por lo tanto, para abordar de manera más adecuada las necesidades de bienestar de los terneros lecheros en particular, y para reducir nuestra dependencia de los antibióticos como tratamiento para las infecciones bacterianas, se requieren esfuerzos continuos para reforzar de manera óptima la resistencia natural a las enfermedades y la salud del animal.

Durante los primeros años de vida, los terneros dependen predominantemente de su sistema inmunitario innato para protegerse contra las enfermedades, ya que el brazo adaptativo de su sistema inmunitario se desarrolla gradualmente hasta la madurez aproximadamente 6 meses después del nacimiento4. Un contribuyente clave para la preparación óptima del sistema inmunitario adaptativo y el desarrollo de la homeostasis es el establecimiento del microbioma. Se cree que los cultivos iniciadores iniciales para el desarrollo microbiano se originan a partir del calostro ingerido inmediatamente después del nacimiento, aunque investigaciones más recientes sugieren que puede ocurrir cierta exposición en el útero5. El neonato consume una dieta exclusivamente láctea y se piensa que la colonización del intestino comienza en el íleon y posteriormente se establece a lo largo del extenso tracto prerrumiante en desarrollo6,7. La composición de la microflora intestinal se ha establecido en terneros jóvenes y se ha informado de un predominio de Firmicutes. Sin embargo, se producen cambios dinámicos considerables en la sucesión microbiana a medida que se desarrolla el rumen y se producen mecanismos reguladores homeostáticos de los tejidos8.

Apoyar el establecimiento de un microbioma diverso ahora se considera una característica clave para fomentar el desarrollo óptimo del sistema inmunitario y el establecimiento óptimo de la homeostasis. De hecho, se cree que un microbioma diverso es una característica protectora principal contra los patógenos invasores9, y los factores que contribuyen a la polarización o a la reducción de la diversidad del microbioma (denominado disbiosis) son un factor de riesgo de enfermedad importante. Un estudio reciente en humanos ha demostrado que la suplementación con vitamina D (VitD) aumentó significativamente la diversidad microbiana intestinal. Específicamente, la proporción de Bacteroidetes a Firmicutes aumentó, junto con la abundancia de los taxones probióticos que promueven la salud Akkermansia y Bifdobacterium10. El microbioma oral ha recibido menos atención de investigación que el microbioma intestinal, pero los estudios han identificado una gran cantidad de familias que incluyen Neisseriaceae, Streptococcaceae y Pasteurellaceae, así como Moraxellaceae en la microbiota oral11, pero los efectos de VitD en la abundancia relativa de estas poblaciones aún se desconocen. La suplementación con VitD puede ofrecer un mecanismo para apoyar el desarrollo del sistema inmunológico en terneros jóvenes de leche, sin embargo, el papel de VitD en la regulación del microbioma en el ganado no se ha estudiado previamente.

VitD es un esteroide esencial para la vida en la mayoría de los mamíferos. Las dos formas más prominentes de VitD son ergocalciferol (Vit D2) y colecalciferol (Vit D3). El ergocalciferol se deriva del esteroide vegetal ergosterol, mientras que el colecalciferol se produce en la piel tras la exposición a los rayos UVB del sol12. El ganado puede obtener VitD a través de síntesis dérmica y fuentes dietéticas (heno, ensilaje, sustitutos de leche, etc.). El contenido de Vit D2 en el ensilaje suele ser muy variable y el pasto verde es una fuente pobre de Vit D2; por lo tanto, para los rumiantes en pastoreo, casi toda la VitD proviene de la síntesis dérmica. Aunque la Vit D3 se proporciona en los piensos concentrados, las diferencias en las prácticas ganaderas provocan variaciones en el estado de VitD del ganado entre granjas y a lo largo del año13.

Nuestro trabajo ha establecido recientemente que los niveles circulantes de VitD son subóptimos en terneros lecheros nacidos en primavera14, y que los niveles bajos están asociados con cambios temporales significativos en la inmunidad sistémica, incluidas las poblaciones de células inmunitarias y la expresión de proteínas inmunitarias, incluida la quimiocina, la interleucina 815. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la suplementación con este micronutriente alteraría significativamente el microbioma oral y fecal de las terneras lecheras Holstein-Friesian. Utilizando el mismo modelo de suplementación con VitD, el objetivo de este estudio fue caracterizar las poblaciones microbianas presentes en la cavidad bucal y en las heces que pueden verse alteradas en respuesta a la suplementación con VitD en la dieta.

Las concentraciones circulantes de VitD fueron significativamente divergentes entre los grupos utilizados para la secuenciación del microbioma (P < 0,05, Fig. 1). Para garantizar que no haya impactos negativos en el crecimiento o el bienestar de los animales, se controlaron estos parámetros durante todo el experimento. No hubo diferencia significativa entre los grupos de tratamiento en relación con la incidencia de la enfermedad (P > 0,05). Aunque el grupo Ctl-Out mostró una tendencia hacia pesos finales más bajos al final del experimento, no se detectaron diferencias significativas ni en el peso inicial ni en el aumento de peso corporal (P> 0.05; Figura complementaria S1).

Concentraciones circulantes de niveles de 25OHD en suero de terneros Holstein-Friesian en cada grupo. Los diagramas de caja y las concentraciones de 25OHD en suero en terneros individuales (ng/ml) dentro de cada grupo (n = 6) se muestran con la significación estadística indicada como *p < 0,05. Los terneros fueron un subconjunto de un estudio más amplio, como se publicó anteriormente Flores-Villalva, et al.14.

El microbioma fecal y oral de los terneros difería significativamente (P < 0,05) según el análisis de Permanova y mediante la visualización utilizando la matriz de distancia de Bray Curtis y la escala multidimensional (Fig. 2). En relación con la diversidad alfa, las muestras fecales fueron más diversas según las medidas observadas, Chao1 y Shannon en comparación con las muestras orales (P < 0,05) (datos no mostrados). La diferencia en la composición fue enfatizada aún más por las diferencias a nivel de phylum (Fig. 3). El microbioma fecal tenía un aumento significativo de Firmicutes (94 % frente a 56 %), pero menos Fusobacteria (< 1 % frente a 9 %) y Proteobacteria (< 1 % frente a 23 %) en comparación con el microbioma oral.

Análisis de componentes principales (PC) basado en escalamiento dimensional múltiple y matriz de distancia Bray-Curtis. El análisis enfatiza la clara distinción entre muestras fecales y orales en terneros Holstein-Friesian. N = 22 terneros por grupo.

Composición del microbioma fecal y oral a nivel de filo agrupado por tratamiento y alojamiento. Estos datos ilustran la diferencia entre el microbioma oral y fecal en terneros Holstein-Friesian. N = 4–6 terneros por grupo.

El microbioma fecal estuvo dominado por la familia Ruminococcaceae (> 70 % en promedio), seguida por Lachnospiraceae (15 %), Clostridiaceae (3 %), Peptostreptococcaceae (2 %) y Rikenellaceae (1 %), y el resto de las familias se observaron a menos de 1% (Tabla complementaria S1). A nivel de género, Oscillospira (30 % en promedio) fue el género dominante con Faecalibacterium (11 %), Dorea (10 %), Ruminococcus (6 %), Prevotella (5 %), CF231 (5 %), Clostridium (3 %). y Blautia (2%) destacando (Tabla complementaria S1).

VitD no afectó ninguna medida de diversidad alfa en el estudio actual (Tabla 1). Sin embargo, el alojamiento afectó significativamente a la diversidad Beta en el microbioma fecal (P < 0,05) según el análisis de Permanova y mediante la visualización mediante la matriz de distancia de Bray Curtis y el escalado multidimensional (Fig. 4). Los terneros alojados al aire libre tenían una mayor diversidad según las medidas de Observed, Chao1, Shannon, Simpson y Fisher en comparación con los terneros alojados en el interior (Tabla 1; P < 0,05).

Análisis de componentes principales (PCA) basado en escalamiento dimensional múltiple y matriz de distancia Bray-Curtis. El análisis ilustra la diferencia entre terneros alojados en interiores y al aire libre en muestras recolectadas de heces de terneros Holstein-Friesian. N = 12 terneros por grupo.

Los efectos significativos en el análisis de abundancia diferencial en las muestras fecales se presentan en la Tabla 2, mientras que los resultados completos del análisis se presentan en la Tabla complementaria S1. No hubo un impacto significativo de la suplementación con VitD, o ninguna interacción entre la suplementación con VitD y el tipo de alojamiento en el microbioma fecal a nivel de filo o familia (Tabla complementaria S1). Las familias Peptostreptococcaceae, Rikenellaceae y Ruminococcaceae aumentaron en los terneros mantenidos al aire libre, mientras que los terneros alojados en el interior aumentaron Lachnospiraceae y Prevotellaceae (Tabla 2; P < 0.05).

Hubo interacción entre alojamiento y tratamiento para los géneros Ruminoccocus, CF231 Paludibacter y Oscillospira (Cuadro 2; P < 0.05). Hubo una interacción entre el alojamiento y el tratamiento para los géneros Ruminococcus con suplementos de VitD que aumentaron los Ruminococcus al aire libre, mientras que no se identificó ningún efecto para los terneros alojados en interiores. Hubo una interacción entre el alojamiento y el tratamiento para el género CF231 con la suplementación de VitD aumentando CF231 en el alojamiento interior mientras que la suplementación de VitD disminuyó este género cuando los terneros estaban al aire libre. Hubo una interacción entre el alojamiento y el tratamiento para el género Paludibacter sin ningún efecto identificado en los terneros alojados en interiores, mientras que la suplementación con VitD al aire libre redujo significativamente Paludibacter. Hubo una mayor respuesta a la suplementación con VitD para el género Oscillospira para terneros alojados en interiores en comparación con terneros al aire libre donde la suplementación no tuvo efecto. Independientemente del tipo de alojamiento, los géneros Dorea aumentaron, mientras que Clostridium y Blautia disminuyeron después de la suplementación con VitD (P < 0,05). Los terneros alojados en el interior tenían un aumento de Faecalibacterium, Blautia, Prevotella y Succinivibrio, mientras que 5-7N15 se redujo en comparación con los terneros alojados al aire libre (P < 0,05).

El microbioma oral estaba comprometido de Ruminococcaceae (32%), Pasteurellaceae (17%), Lachnospiraceae (10%), Fusobacteriaceae (6%), Leptotrichiaceae (5%), Neisseriaceae (3%), Moraxellaceae (2%), Peptostreptococcaceae (2 %), Clostridiaceae (2 %), Tissierellaceae (2 %), Flavobacteriaceae (2 %), Mycoplasmataceae (2 %) y Weeksellaceae (2 %) (valores promedio de los datos que se muestran en la Tabla complementaria S3). A nivel de género, el microbioma oral se vio comprometido por Actinobacillus (19 %), Fusobacterium (12 %), Moraxella (5 %), Ruminococcus (4 %), Faecalbacterium (4 %), Clostridium (4 %), Oscillospira (4 %). , Dorea (3%), Ornithobacterium (3%), Helococcus (2%) y Blautia (1%) con otros géneros identificados con menos del 1% de abundancia.

Las medidas de diversidad no se vieron afectadas en las muestras orales (Tabla complementaria S2). Los efectos significativos en el análisis de abundancia diferencial en las muestras orales se presentan en la Tabla 3, mientras que los resultados completos del análisis se presentan en la Tabla complementaria S3. Hubo una interacción entre el tratamiento y el alojamiento para los filos Firmicutes y Proteobacteria (P < 0.05). La suplementación con VitD disminuyó los Firmicutes en terneros alojados en interiores, mientras que los Firmicutes aumentaron cuando los terneros estaban al aire libre. Hubo una interacción entre el tratamiento y el alojamiento para el phylum Proteobacteria con suplementos de VitD que aumentaron las Proteobacterias en el interior mientras que no se identificó ningún efecto en el exterior. Los terneros suplementados con VitD tenían un aumento de Bacteroidetes en comparación con los terneros que no recibieron VitD adicional (P < 0,05). Los phyla Fusobacteria y Actinobacteria se redujeron, mientras que Tenericutes y Cyanobacteria aumentaron en los terneros al aire libre en comparación con los terneros alojados en el interior (Tabla 3).

Hubo interacción entre tratamiento y alojamiento en las familias Pasteurellaceae, Lachnospiraceae, Streptococcaceae y Neisseriaceae (Cuadro 3). La suplementación con VitD en el interior incrementó las Pasteurellaceae en mayor medida que los terneros al aire libre. La suplementación con VitD en el interior disminuyó las Lachnospiraceae mientras que no se identificó ningún efecto en el exterior. Hubo una interacción entre la suplementación con VitD y el alojamiento en la familia Streptococcaceae que aumentó en los terneros alojados en interiores y se redujo en los terneros al aire libre. La suplementación con VitD disminuyó la familia Neisseriaceae en los terneros al aire libre, mientras que este género no se vio afectado cuando los terneros estaban en el interior. La suplementación con VitD incrementó la familia Flavobacteriaceae mientras que Leptotrichiaceae y Moraxellaceae fueron menores en terneros que no recibieron VitD (P < 0.05; Tabla 3). Al comparar terneros alojados al aire libre con terneros alojados en interiores, las leptotrichiáceas, las fusobacteriaceae, las Weeksellaceae y las corynebacteriaceae fueron más altas en los terneros alojados en interiores, mientras que Mycoplasmataceae se redujo en comparación con los terneros del grupo con VitD al aire libre (P < 0,05; Tabla 3).

Hubo una interacción entre la suplementación con VitD y el alojamiento en la abundancia de los géneros Actinobacillus, Streptococcus y Dorea (P < 0.05; Tabla 3). La suplementación en el interior aumentó Actinobacillus en mayor medida que cuando los terneros estaban al aire libre (P < 0,05). La interacción entre la suplementación con VitD y el alojamiento para el género Streptococcus indicó que la suplementación aumentó Streptococcus en el alojamiento interior mientras que no hubo efecto cuando los terneros estaban al aire libre. En el caso de Dorea, la suplementación con VitD redujo el género en interior mientras que se incrementó en terneros en exterior (P < 0,05). La suplementación con VitD redujo los géneros Ruminococcus, Moraxella, Succinivibrio, Prevotella y Clostridium mientras que Flavobacterium aumentó independientemente del tipo de alojamiento (P < 0,05; Tabla 3). Cuando se compararon los terneros alojados al aire libre con los de interior, los terneros al aire libre tenían más Moraxella, Flavobacterium, Sphingomonas, Oscillospira, mientras que los terneros en el interior tenían más Streptococcus, Fusobacterium, Ruminococcus y Ornithobacterium (P < 0,05; Tabla 3).

Una VitD adecuada ahora se considera vital para una salud óptima con investigaciones que identifican asociaciones importantes entre la concentración sanguínea de 25OHD y la función inmunológica. VitD actúa como un activador del sistema inmunológico innato para mejorar la respuesta a la infección. VitD estimula la capacidad microbicida de las células innatas contra patógenos al promover la expresión de proteínas antimicrobianas, disminuir la concentración de iones intracelulares y mejorar la autofagia16,17. Recientemente hemos demostrado cómo la VitD exógena promueve la eliminación de micobacterias en las células sanguíneas periféricas de los terneros18. Además, VitD regula la actividad del sistema inmunitario adaptativo, con efectos comúnmente descritos como una inhibición de la respuesta Th1 y la promoción de la diferenciación de células Th2. Por tanto, la VitD limita el desarrollo de una respuesta inflamatoria excesiva19. Los niveles circulantes de VitD en terneros lecheros nacidos en primavera son deficientes al nacer y subóptimos hasta aproximadamente los 5 meses de vida14,20. Cada vez se establecen más asociaciones entre el microbioma y la salud del huésped en los terneros21 y, debido al vínculo intrínseco entre la función inmunitaria y el microbioma, la influencia de la suplementación con VitD en el microbioma del ternero justifica una mayor exploración. Nuestro trabajo anterior formó una línea de base importante en la caracterización del desarrollo del microbioma8 relacionado con la edad y aquí identificamos la diversidad y los cambios en la composición asociados con la suplementación con VitD. La asociación entre VitD y el microbioma ha sido objeto de múltiples estudios recientes (revisado por Tangestani et al.22). Aunque los mecanismos de los efectos son objeto de análisis en curso, se ha sugerido que la VitD puede aumentar la expresión del péptido de defensa del huésped en el intestino y alterar la expresión de las proteínas de unión estrecha a través de la modulación de VDR, que se expresa ampliamente en los tejidos intestinales10. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue caracterizar las poblaciones microbianas presentes en la cavidad oral y en las heces que pueden verse alteradas en respuesta a la suplementación dietética con VitD en dos condiciones de alojamiento diferentes.

En este estudio, Firmicutes representó más del 90 % del microbioma fecal, mientras que el microbioma oral estaba compuesto por ~ 55 % de Firmicutes, ~ 20 % de Proteobacteria, ~ 10 % de Fusobacteria y ~ 5 % de Bacteroidetes. Esto coincidió en parte con hallazgos previos en los que Firmicutes era el filo dominante en muestras fecales de terneros8,11. En el estudio de Klein-Jöbstl, et al.23, Ruminococcaceae fue la familia dominante en el microbioma fecal de las vacas, lo que concuerda con el presente estudio. Sin embargo, en el estudio de Barden, et al.11 Proteobacteria fue el filo más abundante en las muestras orales mientras que aquí Firmicutes fue el más abundante. También existen similitudes entre el conjunto de datos actual y los estudios previos, ya que las familias, incluidas Pasteurellaceae y Moraxellaceae, también fueron muy abundantes en las muestras orales de terneros11. En el estudio de Owens, et al.24 Proteobacteria dominó el microbioma oral mientras que Bacteroidetes fue dominante en el microbioma fecal de los terneros. La edad de los terneros es probablemente un factor significativo que contribuye a la divergencia entre los informes en la literatura con muestreo que varía de 28 días de edad11 a 60 días de edad24 y ​​el estudio actual donde los terneros tenían 230 días de edad.

Hubo varios cambios interesantes asociados con VitD en el microbioma fecal y, en particular, efectos que diferían según el tipo de alojamiento. Hubo una mayor respuesta a la suplementación con VitD para el género Oscillospira para terneros alojados en interiores en comparación con terneros alojados al aire libre donde la suplementación no tuvo efecto. Se identificó la tendencia opuesta para Ruminococcus con suplementos de VitD que tuvieron un efecto cuando los terneros estaban al aire libre pero no alojados en el interior. Oscillospira degrada las paredes celulares de las plantas y se incrementa cuando se alimenta con forraje fresco25,26,27. Anteriormente, se demostró que Oscillospira era más abundante en novillos que pastaban en pastos en comparación con los novillos en interiores27. Cuando se cambió la dieta de pastoreo a alimentación en interiores, la abundancia de Oscillospira disminuyó, enfatizando un vínculo claro con el pastoreo en pastos27. Esto explica la diferencia entre los terneros alojados en interiores y al aire libre en relación con el microbioma, que probablemente esté relacionado con las diferencias en la dieta ofrecida. En el caso de Ruminococcus, este género no se vio afectado en el interior, pero aumentó más del 6 % en el exterior después de la suplementación con VitD. Ruminococcus tiene una funcionalidad similar a Oscillospira y está involucrada en la degradación de forrajes. Dentro del Phylum Firmicutes y la familia Lachnospiraceae, Dorea aumentó independientemente del tipo de vivienda, mientras que Blautia se redujo. Dorea es activa en la degradación de celulosa y hemicelulosa y se le ha atribuido una mejor salud intestinal en rumiantes neonatales y un aumento de la GMD28,29,30. Blautia está correlacionada con la producción de propionato después de la fermentación del almidón y también se ha asociado con una mejor ADG en terneros31,32. El género Clostridium también se redujo después de la suplementación con VitD. Clostridium contiene especies que causan enfermedades en los terneros, en particular C.perfringens y C.difficile33. Estos cambios sugieren impactos positivos generales en el microbioma intestinal después de la suplementación con VitD.

Las diferencias taxonómicas están asociadas con la suplementación con VitD en este estudio, pero aún no está claro el motivo de la interacción entre VitD y el microbioma. Si bien aún no está completamente confirmado, parece que los efectos sobre el microbioma en este estudio no son una influencia directa, sino más bien una acción posterior a la absorción del micronutriente. Se estableció previamente que VitD es estable en el rumen sin que se detecte degradación y con absorción en el intestino delgado en estudios previos34. Además, VitD no afectó los parámetros de fermentación del rumen en un estudio in vitro con vacas35. Esto sugiere que la influencia de VitD en el microbioma se produce potencialmente a través de la modificación del huésped, probablemente a través de la interacción entre el microbioma y el huésped en el epitelio intestinal. Esta influencia de VitD en el huésped, en particular la inmunidad del huésped, se destacó en un estudio realizado en el mismo grupo de terneros14. Los terneros suplementados con VitD3 en interiores tenían menos neutrófilos, eosinófilos y basófilos circulantes en comparación con los terneros alimentados con control14. Anteriormente, se había establecido que la genética del huésped influye en el microbioma de los rumiantes, ya que tanto Roseburia como Oscillospira se asociaron con SNP que regulan la inmunidad y el metabolismo del huésped, lo que vincula una ruta potencial para que la VitD en este estudio influya en el microbioma36. En este estudio, los terneros se criaron en interiores con ensilaje de pasto o al aire libre en pastos. Esto podría explicar las diferencias en el impacto de la VitD, ya que se sabe que las prácticas de cría influyen en el metabolismo de la VitD37. De hecho, en estudios con humanos y ratones se ha establecido un vínculo entre VitD y el microbioma38,39. Curiosamente, dos familias (Ruminococcaceae y Lachnospiraceae) que eran más altas en el tipo salvaje frente a los ratones que no pueden producir 1,25 (OH) 2D340 también se vieron afectadas por VitD en el estudio actual. Será necesario realizar más investigaciones para comprender mejor este vínculo, en particular tomando muestras directamente de las diversas regiones del tracto digestivo en lugar de utilizar muestras fecales como sustituto.

En las muestras orales, dentro del filo Proteobacteria hubo interacción entre la suplementación con VitD y el alojamiento en el género Actinobacillus con VitD aumentando este taxón en un 15 % en interiores pero solo en un 6 % en exteriores. En los mismos filos, Moraxella y Succinivibrio se redujeron después de la suplementación con VitD independientemente del alojamiento. Varias especies de Actinobacillus están asociadas con causar la enfermedad Actinobacilosis (lengua de madera), por lo que el aumento en este taxón luego de la suplementación con VitD es sorprendente debido a los vínculos entre VitD y una mejor salud animal. En contraste, los géneros Moraxella y Succinivibrio se redujeron luego de la suplementación con VitD. Moraxella está relacionada con las infecciones oculares a través de Moraxella Bovis41. En el phylum Firmicutes y el Orden Clostridia, hubo varios géneros que fueron influenciados por VitD. Hubo una interacción entre el alojamiento y VitD en el género Dorea que se redujo en terneros alojados en interiores pero aumentó al aire libre, lo que difiere del efecto observado en las heces donde la suplementación aumentó el género Dorea tanto en interiores como en exteriores. Un efecto que podría ser beneficioso es la reducción del género Clostridium, que se redujo después de la suplementación con VitD. Clostridium es un género conocido por contener varias especies que causan enfermedades en los terneros, en particular C.perfringens y C.difficile33. Curiosamente, Clostridium también se redujo en las muestras fecales. Sin embargo, en contraste con la reducción de Clostridium, el género Streptococcus aumentó luego de la suplementación con VitD. Streptococcus es un género conocido por contener una serie de bacterias patógenas como Streptococcus bovis42, por lo que, de nuevo, el hecho de que la VitD esté aumentando este género es sorprendente. Es necesario realizar más investigaciones para examinar la influencia que estos cambios identificados tienen en la pantorrilla.

Si bien el objetivo principal de este estudio es evaluar el impacto de la suplementación con VitD en dos tipos de alojamiento diferentes (interiores y exteriores), también es interesante comparar el microbioma de los terneros alimentados en interiores y exteriores, independientemente de la suplementación. El análisis de diversidad beta se utiliza para determinar las diferencias de composición entre los tipos de muestra e indicó una clara distinción entre el tipo de alojamiento en las muestras fecales, pero ninguna diferencia en las muestras orales. Existen numerosos factores que, de hecho, podrían estar causando esta diferencia entre los terneros alojados en el interior y los terneros al aire libre que podrían estar influyendo en el microbioma. Los grupos de interior versus exterior se manejaron de manera similar hasta el destete en aproximadamente d70. Después de este punto de tiempo, el grupo de interior permaneció adentro y se alimentó ad libitum con ensilado de pasto y heno, mientras que el otro grupo se trasladó al exterior y se le ofreció pasto de pastoreo. Estas diferencias dietéticas son probablemente el factor dominante en las alteraciones identificadas en el microbioma. Se identificaron diferencias en la diversidad alfa en las muestras fecales con terneros alojados al aire libre que tenían una mayor diversidad en función de todas las medidas de diversidad examinadas sin diferencias en las muestras orales. Curiosamente, esto apunta a cambios sustanciales en la abundancia de taxones, la riqueza de taxones y la uniformidad. El aumento de la diversidad bacteriana se asocia con una mayor robustez frente a las influencias ambientales43 y una mejor salud intestinal44. Como el efecto de la vivienda no fue el enfoque principal de este estudio, hay varios factores que no se controlaron, como la dieta y el medio ambiente, que podrían estar afectando el microbioma, pero se requiere un estudio futuro más detallado para establecer la influencia del tipo de vivienda en el microbioma del ternero. Además, los pesos finales de los terneros de cada grupo sugieren que los terneros Ctl-Out tienen un peso corporal más bajo, aunque esta diferencia no es significativa. Será relevante para estudios futuros examinar si la suplementación con VitD apoya el crecimiento de los terneros en una cohorte más grande de terneros.

La mortalidad y la morbilidad neonatal siguen siendo un problema importante para la industria láctea3 y los sistemas de gestión deben adaptarse para reducir el bienestar negativo y las prácticas dependientes de antibióticos. Las estrategias nutricionales para apoyar el desarrollo óptimo del sistema inmunológico pueden ser una promesa significativa para reducir estas pérdidas, particularmente en terneros lecheros criados intensivamente. Se conocen múltiples factores que regulan la síntesis cutánea de VitD3, incluidos la latitud, la altitud y el tiempo de exposición a la luz solar45. Aquí, este análisis preliminar sugiere que la suplementación con VitD altera significativamente el microbioma en los terneros. El papel antimicrobiano e inmunorregulador de VitD puede ofrecer un suplemento efectivo y de bajo costo para estimular la función inmunológica en el ternero46 y el impacto en el microbioma oral y fecal en este estudio ofrece un área intrigante para una mayor investigación sobre fermentación, digestibilidad de nutrientes y salud. Estas alteraciones en las poblaciones microbianas pueden ayudar a aumentar la resistencia a las enfermedades en los terneros lecheros.

Los animales utilizados en este estudio formaron parte del estudio descrito por Flores-Villalva, et al.14 y se describe brevemente a continuación. Cuarenta y ocho terneros machos Holstein-Friesian con un peso promedio de 42 kg de una sola granja, nacidos entre febrero y marzo de 2020, se inscribieron en el experimento. El experimento fue un diseño de bloques completos al azar con un arreglo factorial de tratamientos de dos por dos, con terneros asignados al azar a uno de los 4 tratamientos (n = 12). Los tratamientos se organizaron como un diseño factorial con dos dietas de vitamina D3 (Ctl y VitD) y dos condiciones de acceso a la luz solar (interior = Adentro o exterior = Afuera). Para las dietas Ctl se utilizó un sustituto de leche comercial (MR) con 6000 UI/kg de VitD3 y un pellet comercial con 2000 UI/kg de VitD3. Para las dietas con VitD3, el MR y el sedimento se complementaron con VitD3 para lograr 10 000 UI/kg y 4000 UI/kg de VitD3, respectivamente. Por tanto, los cuatro tratamientos con 12 terneros cada uno fueron: Ctl-In: Interior y 6000 UI/Kg en MR + 2000 UI/Kg de VitD3 en pienso; VitD-In: Interior y 10.000 UI/Kg en MR + 4000 UI/Kg de VitD3 en pienso; Ctl-Out: Exterior y 6000 UI/Kg en MR + 2000 UI/Kg de VitD3 en pienso; VitD-Out: Exterior y 10.000 UI/Kg en MR + 4000 UI/Kg de VitD3 en pienso. El sustituto de leche se administró hasta el destete, después de lo cual se proporcionó la suplementación solo en el alimento. El análisis de composición tanto del sustituto de leche comercial como de los gránulos comerciales se proporciona en datos complementarios. Los tratamientos posteriores al destete se administraron desde el día 70 hasta el día 230 al finalizar la prueba. Los terneros se pesaron al inicio del experimento y posteriormente el día 70, d130, d160 y d230. Al comienzo del experimento se administró una inyección única de 50.000 UI de VitD3 por vía subcutánea a todos los terneros, excepto Ctl-In, que recibió una inyección de vehículo con etanol. La VitD3 se preparó a partir de concentrado de polvo seco (Rovimix D3 500, DSM Nutritional Products) que contenía 500.000 UI por gramo de VitD3 mediante la adición de 0,5 g del concentrado a agua destilada. Los suplementos se prepararon frescos semanalmente y se almacenaron a 4 °C. Se agregaron suplementos una vez al día al MR y se cubrieron los gránulos después del destete.

Todos los terneros se alojaron en grupo en Teagasc Animal and Bioscience Research Centre, Co. Meath, Irlanda. Después del destete a los 70 días, los grupos promedio al aire libre (Ctl-Out, VitD-Out) se trasladaron a las áreas de pastoreo y se pastorearon rotativamente de mayo a octubre. Los grupos de interior (Ctl-In, VitD-In) se mantuvieron en confinamiento durante la duración del ensayo y se les ofreció heno y ensilaje ad libitum. El análisis de las concentraciones séricas de 25OHD se realizó como parte de un estudio previo14. Durante el transcurso del experimento se registraron signos de enfermedad respiratoria o gastrointestinal; sin embargo, no se observaron diferencias entre los grupos. Se perdió un ternero pero no estuvo relacionado con los tratamientos experimentales. El peso de cada ternero se registró al nacer y al final de la prueba y se presenta en la Figura complementaria S1.

Para examinar el impacto de la suplementación con VitD3 y el tipo de alojamiento en el microbioma, se recolectaron hisopos de la región bucal de la boca y del recto después de 230 días de suplementación de seis terneros por grupo de tratamiento. Se insertaron hisopos en la boca o el recto, se giraron en el sentido de las agujas del reloj tres veces y se almacenaron en tubos que contenían tampón PBS y se transfirieron a hielo seco. Luego, los hisopos se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

La extracción del ADN bacteriano de los hisopos fecales y orales y la posterior secuenciación de alto rendimiento de la región hipervariable V3–V4 del gen 16S rRNA bacteriano se realizó en una plataforma Illumina MiSeq de acuerdo con sus protocolos estándar (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania) y como se describió previamente47. La región V3-V4 se amplificó por PCR con cebadores universales que incorporan adaptadores que incluyen secuencias de nucleótidos para cebadores de índice directo e inverso. La purificación de amplicón se realizó con perlas AMPure XP (Beckman Coulter, Indianápolis, IN, EE. UU.) y se preparó para la PCR índice utilizando cebadores índice Nextera XT (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.)48. El paso de purificación se repitió en las muestras indexadas usando perlas AMPure XP y se evaluó usando un analizador de fragmentos (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). Después de este paso, se hizo una piscina utilizando cantidades iguales de cada muestra experimental. Luego, la biblioteca se analizó con el kit de ADN Bioanalyzer 7500 (Agilent) y se secuenció con la química V3–V4 (2 lecturas de extremo emparejado de 300 pb).

Se utilizó Quantitative Insights into Microbial Ecology (Qiime) para examinar los datos de secuenciación49. Los cebadores de secuenciación se eliminaron con el paquete cutadapt y las lecturas de extremos emparejados resultantes se fusionaron con la función de lecturas de extremos emparejados dentro de Qiime usando los criterios estándar. La demultiplexación de lecturas sin procesar finales emparejadas se realizó a través de la función de bibliotecas divididas y el filtrado de calidad se realizó utilizando parámetros QIIME predeterminados. Solo se conservaron las lecturas que no contenían caracteres ambiguos, coincidencias de código de barras no exactas, una longitud de secuencia > 225 nucleótidos y una puntuación de calidad de lectura > 27. La función uclust en Qiime se usó para seleccionar OTU según una similitud de secuencia del 97 %. Se eliminaron los singletons, ya que solo se conservaron las OTU que estaban presentes al nivel de al menos dos lecturas en más de una muestra, mientras que las secuencias quiméricas se eliminaron con ChimeraSlayer50,51. La base de datos GreenGenes asignó OTU a diferentes niveles taxonómicos. Se combinó una combinación de la tabla OTU mormalizada, los datos fenotípicos experimentales y el árbol filogenético para producir el objeto phyloseq para su posterior análisis (http://www.r-project.org; versión 3.5.0, consultada el 25 de marzo). La dinámica de riqueza y diversidad en la microbiota se calculó con los índices observados, Chao1, Shannon, Simpson y Fisher. Los índices de diversidad de Simpson y Shannon dan cuenta de los parámetros de riqueza y uniformidad. Las medidas de diversidad beta son una medida de la separación de la estructura filogenética de la OTU en una muestra en comparación con todas las demás muestras. Esto se estimó normalizando los datos para que los recuentos de características taxonómicas fueran comparables entre muestras. Se consideraron varias métricas de distancia para calcular la matriz de distancia de los diferentes métodos de reducción multidimensional. Estos incluían distancia UniFrac ponderada/no ponderada y métricas de distancia no filogenéticas (es decir, divergencia de Bray-Curtis, Jensen-Shannon y Euclidian) usando phyloseq en R52,53. Las pruebas de abundancia diferencial se realizaron en tablas extraídas del objeto phyloseq a nivel de filo, familia y género. Los datos se analizaron utilizando el procedimiento PROC Glimmix dentro del Statistical Analysis Software (SAS) 9.4 (SAS, 2013). El modelo evaluó los efectos principales del tratamiento (Ctrl vs. VitD) y alojamiento (interior vs. exterior) y su interacción asociada con el ternero individual como unidad experimental. Se utilizaron 6 terneros por grupo de tratamiento para el análisis estadístico de las abundancias bacterianas relativas con la excepción del grupo VitD-In en las muestras orales que solo contenían cuatro muestras debido a un ADN inadecuado en los hisopos. Los resultados se presentan utilizando los valores de P ajustados de Benjamini-Hochberg (BH).

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Teagasc (TAEC237-2019) y se realizaron bajo la licencia experimental (AE19132/P105) de la Autoridad Reguladora de Productos Sanitarios de acuerdo con la Ley de crueldad hacia los animales (Irlanda 1876) y la Directiva de la Comunidad Europea 2010/63/UE. La presentación de informes en el manuscrito sigue las recomendaciones de las directrices ARRIVE.

Los datos de la secuencia del gen 16S rRNA se depositaron en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el número de registro del estudio PRJEB56677.

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La financiación del estudio se proporcionó a través de una subvención de la Science Foundation Ireland a Kieran Meade (17/CDA/4717). SFV también reconoce a Conacyt México por la beca de doctorado otorgada.

Escuela de Agricultura y Ciencias de la Alimentación, University College Dublin, Belfield, Dublin 4, Irlanda

S. Vigors, S. Flores-Villalva y KG Meade

CENID Fisiología, INIFAP, Querétaro, México

S. Flores-Villalva

Instituto Conway de Investigación Biomolecular y Biomédica, University College Dublin, Belfield, Dublín 4, Irlanda

KG Meade

Instituto de Alimentación y Salud, University College Dublin, Belfield, Dublín 4, Irlanda

S. Vigors y KG Meade

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Concibió y diseñó el estudio, diseñó los experimentos: SFV, SV y KM Realizó los experimentos: SFV y SV Análisis de datos: SV Escribió y editó el artículo: SFV, SV y KM Interpretación de los resultados: todos los autores. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a KG Meade.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Vigors, S., Flores-Villalva, S. & Meade, KG El impacto de la suplementación con vitamina D3 en el microbioma fecal y oral de los terneros lecheros en el interior o en el pasto. Informe científico 13, 9111 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34840-2

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Recibido: 19 Octubre 2022

Aceptado: 09 mayo 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34840-2

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