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Sep 13, 2023

Serina ADP

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3200 (2023) Citar este artículo

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En la respuesta al daño del ADN de los mamíferos, la señalización de la ribosilación de ADP es de crucial importancia para marcar los sitios de daño del ADN, así como para reclutar y regular los factores de reparación. Específicamente, el complejo PARP1:HPF1 reconoce el ADN dañado y cataliza la formación de marcas de ribosilación de ADP unidas a serina (mono-Ser-ADPr), que se extienden en polímeros de ADP-ribosa (poli-Ser-ADPr) por PARP1 solo. PARG invierte Poly-Ser-ADPr, mientras que ARH3 elimina el terminal mono-Ser-ADPr. A pesar de su importancia y aparente conservación evolutiva, se sabe poco sobre la señalización de ribosilación de ADP en animales no mamíferos. La presencia de HPF1, pero la ausencia de ARH3, en algunos genomas de insectos, incluidas las especies de Drosophila, plantea dudas sobre la existencia y la reversión de la ribosilación de serina-ADP en estas especies. Aquí mostramos mediante proteómica cuantitativa que Ser-ADPr es la principal forma de ADP-ribosilación en la respuesta al daño del ADN de Drosophila melanogaster y depende del complejo dParp1:dHpf1. Además, nuestras investigaciones estructurales y bioquímicas descubren el mecanismo de eliminación de mono-Ser-ADPr por parte de Drosophila Parg. Colectivamente, nuestros datos revelan que Ser-ADPr mediado por PARP: HPF1 es una característica definitoria del DDR en Animalia. La sorprendente conservación dentro de este reino sugiere que los organismos que llevan solo un conjunto central de enzimas metabolizadoras de ADP-ribosilo, como Drosophila, son organismos modelo valiosos para estudiar el papel fisiológico de la señalización de Ser-ADPr.

La ADP-ribosilación (ADPr) es una modificación postraduccional de proteínas que implica la transferencia de fracciones de ADP-ribosa de NAD+ a una proteína diana. Está involucrado en la regulación de una amplia gama de procesos celulares, como la reparación del ADN, la regulación transcripcional, la inmunidad y el metabolismo microbiano, entre otros1,2,3,4. Las unidades de ADP-ribosa se pueden unir a una variedad de cadenas laterales de aminoácidos, entre otras, con funcionalidades ácidas (Glu/Asp), básicas (Arg/Lys), hidroxilo (Ser/Tyr) y tiol (Cys)2,5. Algunos escritores, como PARP1, PARP2 y tankyrase1/2 (también denominado PARP5a/b) pueden extender la modificación inicial conocida como mono(ADP-ribosilación) (MARylation) y crear polímeros de ADP-ribosa lineales o ramificados conocidos como poli(ADP -ribosilación) (PARilación)6,7,8.

La unión de PARP1/2 induce la proteína ADPr dependiente de PARP1/2 en las roturas del ADN, lo que da lugar a señales de ADPr que activan y controlan una variedad de mecanismos de respuesta al daño del ADN (DDR) necesarios para la descompactación de la cromatina y el reclutamiento de factores de reparación4 ,9. Estudios anteriores mostraron que PARP1 y PARP2 catalizan la modificación de glutamato/aspartato in vitro10, mientras que el análisis espectrométrico de masas reveló que la serina-ADPr es el principal residuo modificado por ADPr durante el daño del ADN en células humanas11,12,13,14. Esta discrepancia se resolvió con el descubrimiento de la proteína auxiliar, el factor 1 de PARilación de histonas (HPF1)11,15, que completa el sitio activo de PARP1/2 al contribuir con residuos catalíticos y de unión al sustrato16,17,18. Además, el complejo PARP1/2:HPF1 también es responsable de la modificación menos conocida de los residuos de tirosina19,20.

ADPr es altamente dinámico y debe mantenerse estrictamente regulado debido al alto gasto de energía asociado. Por lo tanto, una vez que se ha logrado una respuesta celular adecuada, la señalización de ADPr cesa y las unidades de ADP-ribosa utilizadas se reciclan mediante borradores especializados que convierten la ADP-ribosa en otros nucleótidos, incluidos ATP y NAD+21. La principal enzima responsable de degradar la mayor parte de las cadenas PAR es la poli(ADP-ribosa)glucohidrolasa (PARG), que hidroliza el enlace acetal dentro del polímero ADP-ribosa, pero no puede revertir el enlace proteína-ribosa22,23,24. En las células humanas, esta reacción específica, la eliminación de Ser-ADPr, se lleva a cabo por la (ADP-ribosil)hidrolasa 3 (ARH3)23,25.

En particular, la interacción del establecimiento de ADPr por los complejos PARP1/2:HPF1 con la eliminación de la modificación paso a paso por PARG y ARH3 es integral para el control de la reparación del ADN y la regulación de la estructura de la cromatina8,15,26,27,28. Recientemente también se demostró que estos componentes son determinantes críticos de la respuesta a los inhibidores de PARP clínicamente relevantes27,29,30. A pesar de la importancia de la señalización de Ser-ADPr en los mamíferos, su relevancia para Animalia fuera del linaje de los mamíferos sigue siendo difícil de alcanzar. Si bien las PARP y ADPr se han estudiado previamente en Drosophila melanogaster31, aún no se ha establecido la naturaleza del residuo predominantemente modificado con ADPr en este organismo modelo. También se ha demostrado que Drosophila Parp (dParp) y Parg (dParg) están implicadas en varias funciones biológicas, como DDR32, regulación transcripcional33,34 y remodelación de la cromatina35,36,37,38,39, entre otras. Además, se descubrió que dParp es un gen esencial en Drosophila, cuya deleción es letal durante la transición de la etapa de larva a la de pupa34,40. La expresión de mutaciones de pérdida de función de dParg también induce un fenotipo larvario letal a 25 °C. Sin embargo, el 25% de las moscas mutantes fueron capaces de progresar a la etapa adulta a 29 °C, aunque presentando un fenotipo de neurodegeneración progresiva ligado a la acumulación de PAR en las neuronas41. Además, la manipulación de los niveles de expresión del gen dParp o dParg condujo a fenotipos alterados en modelos de moscas de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson42,43, la enfermedad de Alzheimer44 y la esclerosis lateral amiotrófica45. Sin embargo, no se sabe si dParp coopera con dHpf1 y, de ser así, si la modificación resultante se localiza predominantemente en residuos de serina.

Aquí, informamos la existencia de un sistema de señalización Ser-ADPr abundante y conservado en Drosophila catalizado por dParp: dHpf1 con una funcionalidad en gran medida comparable a la señalización ADPr inducida por DDR en humanos. Además, mostramos que, si bien Drosophila carece de ARH3, existe una sorprendente adaptación evolutiva de dParg que confiere equivalencia funcional tanto a PARG humana como a ARH3. La conservación y la relativa simplicidad de Ser-ADPr en Drosophila, con solo una PARP asociada a la reparación del ADN y una hidrolasa opuesta, hace que las moscas de la fruta sean un modelo atractivo para una mayor investigación de esta importante modificación.

Hasta la fecha, Ser-ADPr solo se ha estudiado en vertebrados. Nuestro análisis filogenético reveló que HPF1 se ha conservado en prácticamente todos los metazoos, incluidas ramas primitivas como corales y esponjas, así como organismos conocidos por pérdidas frecuentes de genes como D. melanogaster y Caenorhabditis elegans (Fig. 1 y Datos complementarios 1). Además, HPF1 se encuentra en muchos protozoos. De manera similar, ARH3 se distribuye de manera salvaje entre los metazoos, pero solo se puede encontrar esporádicamente dentro de Amoebazoa y Alveolata (Datos complementarios 1). La aparición de estos dos genes cruciales para el establecimiento y eliminación de Ser-ADPr en la evolución temprana del reino Animalia sugiere fuertemente que este es el origen de esta variación de señalización de ADP-ribosilación. Sorprendentemente, nuestro análisis reveló que falta ARH3 en varios linajes eucariotas, incluidos Nematoda, Lepidoptera y la mayoría de los dípteros, incluidas todas las especies de Drosophila. Sin embargo, estas especies deficientes en ARH3 aún conservan el principal degradador de PAR, PARG, así como HPF1. Estos hallazgos sugieren que el ciclo Ser-ADPr en Drosophila puede diferir de otros metazoos y, por lo tanto, justifica una investigación más detallada.

El árbol filogenético se construyó con secuencias de aminoácidos aisladas de su contexto proteico completo mediante alineación de secuencias múltiples. La historia evolutiva se infirió usando el método de máxima verosimilitud bajo el modelo LG de sustitución de aminoácidos implementado en MEGA11. Se muestra el árbol de consenso bootstrap y se infirió a partir de 1000 repeticiones para representar la historia evolutiva de los taxones analizados. Las especies en las que no se pudo identificar ARH3 mediante la búsqueda BLAST están resaltadas en rojo. Los clados relevantes se resaltan con ramas de colores (Insecta, azul; Mammalia, verde; Nematoda, naranja; Protozoa, marrón). Los datos de secuencia se proporcionan en Datos complementarios 1.

Para investigar esta hipótesis, primero confirmamos que todos los componentes, dParp, dHpf1 y dParg, se localizaron en el núcleo de las células S2R+ (Fig. 1A complementaria) antes de avanzar para dilucidar la dinámica de ADPr en Drosophila después del daño en el ADN. Expusimos las células S2R+ al daño del ADN por peróxido de hidrógeno (H2O2) y metanosulfonato de metilo (MMS), luego comparamos el patrón de ADPr antes y después del daño del ADN mediante el uso de diferentes anticuerpos y reactivos anti-ADPr (Fig. 2A). Observamos que ADPr se induce rápidamente (< 10 min) después de la exposición al H2O2 y decae rápidamente después del estrés (< 120 min; Fig. 2A). Por el contrario, el agente alquilante MMS mostró una respuesta ADPr menos pronunciada comparable a las células U2OS en las mismas condiciones de ensayo (Fig. 2A). El patrón general de poli-ADPr refleja el de las células U2OS humanas con bandas prominentes correspondientes a histonas y PARP1. Si bien no podemos excluir por completo un origen diferente de la señal, la aparente similitud de la señal S2R+ ADPr con la célula humana U2OS, para la cual las histonas y hPARP1 se han informado como los dos objetivos principales de ADPr11,12,15 inducido por daño en el ADN, sugiere fuertemente que esta señal ADPr se relaciona con histonas y dParp. Además, estos datos revelaron que las células humanas y de Drosophila exhiben dinámicas de ADPr comparables en respuesta al daño en el ADN14,15,25. Para determinar si dParp y dHpf1 se reclutan activamente en sitios de lesiones de ADN, las células S2R+ se transfectaron con GFP-dParp o GFP-dHpf1 y se sometieron a microirradiación láser acoplada a imágenes de células vivas (Fig. 2B). Observamos un fuerte reclutamiento de dParp a los sitios de daño segundos después del daño inducido por láser, comparable a lo que se ha descrito con hPARP128,46. De manera similar, también observamos el rápido reclutamiento de dHpf1 a los sitios de daño, aunque no en la misma medida que dParp. Esto imita el perfil de reclutamiento humano donde PARP1 supera el reclutamiento de HPF128.

Se trataron células de Drosophila S2R+ y U2OS humana con H2O2 2 mM o MMS 5 mM y se analizaron en los puntos de tiempo indicados. Las células se lisaron y las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y luego se analizaron los niveles de poli-ADPr mediante inmunotransferencia. Se utilizó tinción con actina y Ponceau S como controles de carga. Las etiquetas 'PARP' e 'histonas' junto a la imagen indican los tamaños aproximados donde se pueden encontrar estas proteínas. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. B Imágenes representativas (arriba) y cinética (abajo) del reclutamiento de EGFP-dParp y EGFP-dHpf1 en sitios de daño en el ADN inducido por irradiación con láser de 405 nm, en células Drosophila S2R+. Barra de escala, 2 µm. Los datos de B son representativos de 3 réplicas independientes (6–10 células por réplica por condición) con n = 24 células para EGFP-dParp y n = 22 células para EGFP-dHpf1 y representan valores medios normalizados ± SEM. Los sitios de irradiación se indican con flechas amarillas. Las células C S2R+ se pretrataron con DMSO o PARGi 2 μM (PDD00017273) durante 16 h, seguido de un tratamiento con H2O2 2 mM durante el tiempo indicado en ausencia o presencia de PARGi. Los niveles de poli-ADPr (panel izquierdo) y pan-ADPr (panel derecho) se analizaron mediante inmunotransferencia. Las etiquetas 'PARP' e 'histonas' junto a la imagen indican los tamaños aproximados donde se pueden encontrar estas proteínas. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares.

Se ha demostrado la actividad hidrolasa PAR canónica de dParg32,41,47,48. Para confirmar que dParg regula los niveles de PARilación celular durante el daño del ADN, tratamos las células S2R+ con el inhibidor de PARG PDD00017273 (PARGi)49. En comparación con las células de control que se trataron con dimetilsulfóxido (DMSO) como control negativo, las células S2R+ tratadas con PARGi mostraron niveles más altos de proteínas PARiladas en el estado no estimulado (Fig. 2C). También confirmamos que se indujo PARilación en células S2R+ tratadas con PARGi después del daño en el ADN (Fig. 2C). Por el contrario, solo detectamos diferencias insignificantes en pan-ADPr (combinación de MAR y PARilación) entre las células S2R + tratadas con DMSO y PARGi en condiciones no estimuladas (Fig. 2C). Sin embargo, observamos que ADPr se estimuló drásticamente en las células S2R+ tratadas con PARGi tras el daño del ADN en comparación con las células S2R+ tratadas con DMSO (Fig. 2C). Estos datos sugieren que la PARGi desarrollada contra la PARG humana (hPARG) inhibió eficazmente la actividad de la dParg, bloqueando así la degradación de ADPr en Drosophila y permitiendo el enriquecimiento de los sitios de ADPr.

A continuación, nuestro objetivo fue identificar las proteínas específicas que están ribosiladas con ADP en células de Drosophila S2R+ mediante análisis espectrométrico de masas. Con este fin, empleamos el enfoque de enriquecimiento Af1521 bien establecido50,51,52 y analizamos extractos de proteínas de células S2R+ tratadas con DMSO y PARGi en ausencia o presencia de daño en el ADN (Fig. 3A). En general, identificamos con confianza 514 sitios ADPr (probabilidad de localización> 0.9), correspondientes a 296 proteínas objetivo ADPr en células Drosophila S2R + (Fig. 3B, C y Datos complementarios 2). De manera tranquilizadora, los datos demostraron una buena probabilidad de localización con> 75% de las coincidencias de espectro de péptidos ADPr (PSM) que poseen una probabilidad de localización> 90% (Fig. 2A complementaria). En general, observamos un alto grado de reproducibilidad entre nuestras réplicas experimentales, con la mayor variación presente en las muestras tratadas con H2O2 (Fig. 3C, D y Fig. 2B complementaria).

Una visión general experimental. Los cultivos de células S2R+ se trataron con DMSO o PARGi 2 μM (PDD00017273) en condiciones de control o condiciones de daño del ADN (H2O2) por cuadruplicado. Los lisados ​​se digirieron en solución y los péptidos modificados con ADPr se enriquecieron utilizando Af1521 marcado con GST producido internamente. Las muestras de ADPr se analizaron en un Thermo Orbitrap Fusion Lumos utilizando fragmentación basada en EThcD. La figura se generó en parte utilizando Servier Medical Art, proporcionado por Servier, con licencia Creative Commons Attribution 3.0 unported. B Histograma que muestra el número total de sitios y proteínas modificados con ADPr identificados y localizados. Diagramas de C Venn que representan la distribución de péptidos ribosilados con ADP únicos identificados en los cuatro enfoques diferentes. D Correlación promedio de Pearson de sitios ADPr identificados de las cuatro condiciones. Se representan los valores medios de n = 6 ± DE. E Resumen del número de sitios ADPr identificados y localizados. n = 4 réplicas de cultivos celulares, los datos se presentan como valores medios ± SEM. (F) Como (D), que muestra la intensidad de ADPr. Cada condición de cultivo celular se preparó por cuadruplicado y los datos se presentan como valores medios ± SEM. G Diagrama de Venn escalado que representa la superposición entre los sitios ADPr identificados en condiciones de DMSO y PARGi, ambos con tratamiento con H2O2. Red H STRING que visualiza interacciones funcionales entre proteínas con sitios ADPr que se encuentran específicamente en condiciones tratadas con PARGi. La puntuación de interacción mínima requerida se fijó en un nivel de confianza alto (0,7) y las proteínas desconectadas se omitieron de la red. Las proteínas se anotaron con colores como se destaca en la leyenda de la figura.

Identificamos el mayor número de sitios ADPr en muestras de PARGi tratadas con H2O2 (483 en total), seguidas de muestras de DMSO tratadas con H2O2 (362 en total, figura complementaria 2C). En general, el daño del ADN resultó en la mayor diferencia en el ADP-ribosiloma (Fig. 2D complementaria) y, en promedio, notamos el mayor aumento en la cantidad de sitios ADPr al comparar células tratadas con DMSO expuestas al daño del ADN con células sin daño. Células tratadas con DMSO, con ~6 veces más sitios detectados tras el tratamiento con H2O2 (Fig. 3E). Se observó la misma tendencia en las células tratadas con PARGi, con ~5 veces más sitios detectados tras el tratamiento con H2O2. Este aumento en el número de sitios de ADPr tras el daño del ADN fue incluso más prominente para la intensidad de los péptidos modificados con ADPr (Fig. 3F). Aquí, observamos en promedio ~ 29 veces y ~ 30 veces más intensidad de ADPr para muestras de DMSO tratadas con H2O2 y muestras de PARGi, respectivamente. Para las muestras inducidas por daños en el ADN, la adición de PARGi resultó en una intensidad ~2 veces mayor en comparación con la condición de DMSO. Tras la inducción del daño en el ADN, la superposición entre las células tratadas con DMSO y las tratadas con PARGi fue alta (66 %), mientras que ~29 % de los sitios fueron específicos para las muestras tratadas con PARGi (Fig. 3G). Lo más probable es que la última fracción represente una abundancia fisiológicamente baja o sitios de recambio rápido que se estabilizaron mediante el tratamiento con PARGi. Los sitios específicos para las muestras tratadas con PARGi en condiciones de daño en el ADN se enriquecieron en proteínas involucradas en el procesamiento del ARN, la organización cromosómica y el ribosoma (Fig. 3H). Sin embargo, los cambios estadísticamente significativos se limitaron a cinco sitios regulados positivamente con el tratamiento con PARGi y un sitio regulado positivamente en muestras tratadas con DMSO (Fig. 2E complementaria).

Como se observó en células humanas11,12,14,50, prácticamente todos los sitios aceptores de ADPr identificados detectados en este estudio se localizaron en residuos de serina en estas condiciones experimentales (Fig. 4A y Datos complementarios 2), lo que demuestra que Ser-ADPr es la forma principal de ADPr en Drosophila DDR como se observa en humanos. Dado que nuestra investigación anterior sobre el enfoque de enriquecimiento de Af1521 no indicó ningún sesgo hacia un enlace específico de proteína-ADP-ribosa50, sugerimos que si se produce la modificación de otros residuos de aminoácidos en Drosophila, su abundancia podría estar por debajo del límite de detección. Descubrimos que la mayoría de los residuos de serina ribosilados con ADP (69,4 %) residían en el motivo de lisina-serina (KS) como se ve en humanos13,51, lo que sugiere que el consenso de orientación de Ser-ADPr se conserva evolutivamente (Fig. 4B y Datos complementarios 2 ). De manera similar, los objetivos de Ser-ADPr son principalmente proteínas nucleares asociadas con el mantenimiento de la estabilidad del genoma y la estructura de la cromatina (Fig. 4C).

Un gráfico circular que visualiza la distribución de residuos de aminoácidos modificados con ADPr. B Análisis de IceLogo que muestra el contexto de la secuencia que rodea los sitios ADPr de serina identificados (estrella azul claro), con residuos de aminoácidos por encima de la línea enriquecida. Las ventanas de secuencia de todos los residuos de serina en las proteínas diana de ADPr se usaron como referencia. C Análisis de ontología génica que visualiza el enriquecimiento de todas las proteínas objetivo de Ser-ADPr en comparación con el genoma total. CC Compartimento celular; BP Proceso biológico; MF Función molecular. D Histograma que muestra la intensidad general de los sitios ADPr, la intensidad ADPr de las histonas y la intensidad ADPr de la histona H1A Ser199. E Tabla que compara los sitios ADPr identificados en Drosophila con los sitios ADPr identificados en humanos. Análisis de automodificación de F dParp, que muestra la abundancia de modificación relativa basada en la intensidad de MS/MS. n = 4 réplicas de cultivos celulares, los datos se presentan como valores medios ± SD. G Alineación de secuencias múltiples de secuencias de dominios de automodificación de PARP de insectos y mamíferos seleccionados. Los sitios Ser-ADPr identificados en dParp y hPARP1 se indican arriba de la alineación con el símbolo de doble daga (‡) y koppa (ϟ), respectivamente. La indexación indica la posición del residuo dParp. La alineación extendida de insectos se proporciona en la Fig. 2 complementaria y las secuencias en la Tabla 1 complementaria.

En líneas celulares humanas, se ha demostrado que las histonas son un objetivo principal de ADPr50,53, y confirmamos que este también es el caso en Drosophila (Fig. 4D). Específicamente, encontramos que la histona H1 de Drosophila es una de las proteínas más ribosiladas con ADP, con modificaciones en múltiples sitios y Ser199 identificado como el residuo modificado más abundantemente (Fig. 4D, Fig. 3A complementaria y Datos complementarios 2). Aunque ninguno de los sitios ADPr de la histona H1 es idéntico a los sitios encontrados en la histona H1 humana, varios otros sitios Ser-ADPr de Drosophila en otras proteínas son idénticos a los de sus homólogos humanos. Por ejemplo, aquí observamos ADPr en Ser10 y Ser28 en la histona H3 de Drosophila, que también se modifican en la histona H3 humana de acuerdo con observaciones previas11,12,14,19,50. Mientras que S10 ADPr se observó en Drosophila en condiciones fisiológicas, ADPr en Ser28 solo se observó con daño en el ADN. Drosophila DNAlig1 se ribosiló con ADP en Ser4, que también se observa en Lig111,12 humano. Otro ejemplo fue Drosophila BLM, que se ribosiló con ADP en Ser1424, correspondiente a Ser1342 humano (Fig. 4E)12.

Además de estos objetivos trans, dParp fue auto-ADP-ribosilado en cuatro residuos de serina (Ser362, Ser491, Ser494 y Ser496) con la intensidad de estos sitios de modificación siguiendo la tendencia global de ADPr total con respecto a los tratamientos con PARGi y H2O2 ( Figura complementaria 3B-E y datos complementarios 2). Sin embargo, la fracción relativa de la intensidad de ADPr varió entre las diferentes condiciones, siendo la Ser494 la más abundantemente modificada en condiciones de control, y la Ser491 tras el daño del ADN (Fig. 4F). La automodificación observada de dParp se ubicó en una región correspondiente al dominio de automodificación descrito anteriormente de PARP1 humano (hPARP1; aa 373–527), que contiene los principales sitios aceptores Ser499, Ser507 y Ser51911,30,50. Entre los cuatro sitios de automodificación de dParp, Ser491 y Ser496 son absolutamente, Ser494 parcialmente (75%, 27 de 36 especies de insectos seleccionadas) y Ser362 no conservado en insectos (Figura 4 complementaria y Datos complementarios 1). Además, el contexto de la secuencia de los sitios de automodificación de PARP1 de mamíferos e insectos se conserva dentro de sus respectivas clases filogenéticas, pero no entre ellas. Llama la atención que el posicionamiento de los principales sitios de automodificación en relación con los otros dominios/regiones de PARP1 está altamente conservado (Fig. 4G). Esto sugiere que el papel potencial de la automodificación de PARP1 en la regulación de su reclutamiento y liberación de sitios de daño en el ADN se basa en el posicionamiento relativo dentro del contexto estructural en lugar del aminoácido exacto. Esto se ve respaldado por la naturaleza de la automodificación de PARP1, que consiste en cadenas de ADP-ribosa alargadas y ramificadas que pueden impedir el reconocimiento del contexto de la secuencia.

Si bien la mayoría de los objetivos de proteína Ser-ADPr identificados se compartieron entre humanos y Drosophila, también identificamos 25 objetivos Ser-ADPr específicos de Drosophila (incluidas once proteínas de función desconocida). El análisis de ontología génica muestra un fuerte enriquecimiento de los componentes celulares asociados con los cromosomas, como la región heterocromática y el cromosoma politene (Fig. 4C). Por ejemplo, ADPr en Ser21 de D1, una proteína cromosómica con múltiples ganchos AT, mostró la segunda intensidad más alta en proteínas totales, mientras que Drosophila HP5, identificada como un interactor HP1, tenía seis sitios de modificación Ser-ADPr (Ser98, Ser101, Ser211, Ser249, Ser347 y Ser399).

Curiosamente, el tratamiento con PARGi duplicó la abundancia de sitios Ser-ADPr, lo que indica que dParg puede ser responsable de eliminar mono-Ser-ADPr en Drosophila (Fig. 4E). Para confirmar esto, primero establecimos que dParg se recluta en sitios de daño de ADN inducido por láser (Fig. 1B complementaria). Luego investigamos el patrón ADPr de las células S2R+ sujetas a una eliminación mediada por ARN de doble cadena (dsRNA) del gen dParg o del gen LacZ (usado como control) antes y después de la exposición a H2O2 (Fig. 5). Se usaron dos dsRNA diferentes, correspondientes a diferentes partes de las secuencias de ADN codificantes de los genes dParg (Fig. 5A), para confirmar que los efectos eran específicos del agotamiento de dParg (Fig. 5B). A continuación, analizamos los productos de ADPr mediada por PARP antes y después del tratamiento con H2O2 mediante inmunotransferencia de extractos de células completas. Curiosamente, los niveles de proteína mono-ADPr en ambas líneas celulares de eliminación de dParg antes y después del daño en el ADN aumentaron (Fig. 5C-E), mientras que los niveles de polímero solo aumentaron después de la exposición al H2O2 (Fig. 5E, F). Esto sugiere que dParg puede escindir enlaces terminales in vivo y, junto con nuestros datos de ribosilómica de ADP, apunta hacia los residuos de serina como objetivos para ADPr inducido por daños reversibles en el ADN.

Una estructura esquemática de la región genómica del gen dParg. Los cuadros blancos y grises muestran la región no traducida y la región codificante del gen dParg, respectivamente. Las líneas superpuestas negras muestran las regiones a las que apuntan los dsRNA de PARG. B El análisis de la expresión génica relativa del gen dParg en células S2R+ determinado por RT-qPCR y normalizado usando el gen RpL39 como control interno. Las barras de error indican SD promedio de tres réplicas independientes. Los asteriscos indican significación estadística en comparación con el control, según lo determinado por la prueba t (****p < 0,0001, valor P de dos colas, PARG-1 frente a LacZ, p = 6,9 × 10−8, PARG-2 frente a LacZ , p = 6,3 × 10−8). Las células de Drosophila S2R+ se trataron con H2O2 2 mM y se analizaron en los puntos de tiempo indicados. Las proteínas C–F de lisados ​​de células completas se separaron mediante SDS-PAGE y luego se analizaron mediante inmunotransferencia usando mono-ADPr- (anticuerpo MAR AbD33204. C mono-ADPr- (reactivo de detección MAR MABE1076. D pan-ADPr- (tanto PAR como Reactivo de detección de MAR, MABE1016. (E) y poli-ADPr- (anticuerpo 4336-BPC-100. F Reactivo de unión. La tinción de Ponceau S y la actina se usaron como control de carga. Las etiquetas 'PARP' e 'histonas' al lado del La imagen indica los tamaños aproximados donde se pueden encontrar estas proteínas Estos experimentos se repitieron de forma independiente tres veces con resultados similares.

A continuación, decidimos reconstituir Ser-ADPr in vitro utilizando proteínas de Drosophila. En primer lugar, demostramos que el complejo dParp1:dHpf1 recombinante puede ribosilar con ADP de forma eficiente la cola de histona H3 in vitro, como se mostró anteriormente para hPARP1:hHPF1 recombinante (Fig. 6A)11,15,18. Para confirmar la naturaleza de la modificación, purificamos el péptido modificado y lo incubamos con dos (ADP-ribosil)hidrolasas humanas, hTARG1 y hARH3, que son específicas para ADPr unido a Glu/Asp y Ser, respectivamente21,25,54. Aquí pudimos demostrar que hARH3 eliminó eficientemente ADPr del péptido de histona H3, mientras que hTARG1 no lo hizo, lo que sugiere fuertemente que la modificación es de hecho Ser-ADPr (Fig. 6B).

Se obtuvo un Mono-Ser-ADPr del péptido de histona H3 (aa 1–21) mediante incubación con complejo hPARP1:hHPF1 recombinante o complejo dPARP1:dHPF1 recombinante utilizando 32P-NAD+ como donante de ADP-ribosa. Las reacciones de PARP se detuvieron mediante la adición de olaparib. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. B Los péptidos de histona H3 ribosilados con ADP de (A) se purificaron a partir de la reacción y se trataron con hARH3 recombinante para confirmar la presencia de Ser-ADPr. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares.

Como se mencionó anteriormente, las especies de Drosophila carecen de ortólogos ARH3 y, por lo tanto, la escisión del enlace (ADP-ribosil)-serilo debe ser realizada por otra enzima. La persistencia de la señal de ribosilación de ADP en nuestros experimentos usando PARGi en células S2R+ sugiere que dParg está involucrado en la rotación de la señal de ADPr dependiente del daño del ADN (Figs. 2B, C, 3 y 4). Además de dParg, Drosophila expresa tres homólogos de hTARG1 (CG33054/dTarg1, CG33056/dTarg2 y CG34261/dTarg355) cuya posible contribución a la eliminación de Ser-ADPr no se puede descartar. Para evaluar la especificidad del sustrato de estas enzimas, realizamos ensayos de (ADP-ribosil) hidrolasa utilizando diferentes sustratos modelo utilizando las hidrolasas humanas caracterizadas hPARG, hARH3 y hTARG1 como controles (Fig. 7 y Fig. 5 complementaria). Específicamente, utilizamos la capacidad previamente establecida de hPARP1 WT para generar poli-ADPr unido a serina15,18 y glutamato5,56 en presencia y ausencia de hHPF1, respectivamente30. Asimismo, generamos las variantes de mono-ADPr utilizando el mutante hPARP1 E988Q, que es una mono-(ADP-ribosil)transferasa57 específica. Tanto hPARG como dParg eliminaron fácilmente los polímeros de ADP-ribosa, mientras que el recambio de hARH3 es menos pronunciado (Fig. 6A y Fig. 5A complementaria), pero fueron incapaces de eliminar el enlace glutamato-ADPr terminal de manera eficiente (Fig. 5A, B complementaria) . Además, mientras que dParg y hARH3 mostraron la capacidad de eliminar mono-Ser-ADPr de péptidos y hPARP automodificado, esto no se observó para hPARG y los ortólogos de TARG de Drosophila (Fig. 7).

A Eliminación de poli-Ser-ADPr en hPARP1 automodificado en presencia de hHPF1 y poli-Ser-ADP-tetrámero de histona H3/H4 ribosilada por (ADP-ribosil)hidrolasas humanas y de Drosophila. La reacción se realizó como en la Fig. 5A, excepto que se usó tetrámero de histona H3/H4 en lugar del péptido de histona H3. El panel inferior muestra la SDS-PAGE teñida con CBB de las proteínas. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. B Eliminación de poli-ADPr en hPARP1 automodificado (0,5 μM), en presencia de hHPF1 (0,5 μM) y péptido H3 mono-Ser-ADP-ribosilado (aa 1–21, 0,5 μg) por humano y Drosophila (ADP-ribosyl )hidrolasas. Las reacciones se realizaron como se describe en la Fig. 5A. El panel inferior muestra la SDS-PAGE teñida con CBB de las proteínas. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. C Eliminación de mono-Ser-ADPr en el péptido H3 de histona mono-Ser-ADP-ribosilado (aa 1–21) por hidrolasas humanas y de Drosophila (ADP-ribosil). Las reacciones se realizaron como se describe en la Fig. 1A y el péptido se purificó como se describe en la Fig. 1B. El panel inferior muestra la SDS-PAGE teñida con CBB de las proteínas. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. D Mediciones de la actividad hidrolasa de las hidrolasas indicadas frente al mono-Ser-ADPr del péptido H2B de histona sintética en S7 utilizando el ensayo AMP-Glo ​​(Promega). Las muestras se corrigen de fondo y se normalizan a hARH3. Los datos representan mediciones por triplicado de tres experimentos independientes ± SEM.

Cuando usamos histona H3.1/H4 serina-PARilada como sustrato13, observamos hPARP1 poli-Ser- y mono-Ser-ADP-ribosilada, lo que nos permitió evaluar por separado la actividad de todas las hidrolasas (ADP-ribosil) probadas contra poli-Ser- y mono-Ser-ADPr (Fig. 7A). El ensayo muestra claramente que dParg invierte eficazmente ADPr de hPARP1 e histonas poli-Ser- y mono-Ser-ADP-ribosiladas. Por el contrario, hPARG solo eliminó PAR de hPARP1 e histonas, mientras que hARH3 eliminó eficientemente mono-Ser-ADPr de hPARP1 pero actuó mal en PAR y no mostró actividad contra las histonas modificadas. Para comparar la capacidad de hARH3 y dParg para eliminar mono-Ser-ADPr, realizamos una reacción de hidrolasas utilizando un péptido sintético de histona H2B, seguida de la conversión de la ADP-ribosa liberada en AMP por NudT5 humano y detección de luminiscencia utilizando el AMP- comercial. Ensayo Glo (Promega; Fig. 7D)58,59,60. Mono-Ser-ADPr hidrolizado tanto por hARH3 como por dParg, aunque con hARH3 más actuando de manera más eficiente. Juntos, nuestros datos muestran que la reversión completa de Ser-ADPr en Drosophila se basa solo en una sola enzima (dParg), a diferencia del sistema humano, que requiere dos enzimas (hPARG y hARH3). Además, la diferencia en la actividad de hidrólisis de mono-Ser-ADPr de hARH3 y dParg sugiere que mantener ambas funciones catalíticas (hidrólisis de mono-Ser-ADPr y PAR) dentro de una sola proteína (PARG) puede tener un costo de eficiencia.

Para investigar la capacidad inesperada de dParg para eliminar tanto cadenas PAR como mono-Ser-ADPr, comparamos su arquitectura de dominio con hPARG (Fig. 8A). Si bien ambas enzimas comparten un motivo de macrodominio catalítico y accesorio conservado, que en hPARG es responsable de la degradación de PAR, dParg carece de la región N-terminal de hPARG y posee un dominio C-terminal adicional (Fig. 8A). Por lo tanto, investigamos si este dominio podría ser responsable de la hidrólisis del enlace serina-ribosa. Para probar esta hipótesis, generamos tres truncamientos del dominio dParg C-terminal y evaluamos la capacidad de estas variantes para eliminar la autoPARilación de hPARP1 (Fig. 8B) y la histona H3 mono-Ser-ADPr (Fig. 8C). Los tres truncamientos mostraron que dParg Δ554–723 perdió actividad contra PAR y mono-Ser-ADPr, probablemente debido a la contribución del dominio C-terminal hacia la integridad estructural de la enzima, mientras que dParg Δ558–723 y dParg Δ574–723 retuvieron la capacidad de eliminar tanto PAR como mono-Ser-ADPr. Estos resultados muestran que la extensión C-terminal de dParg no es responsable de su actividad específica de Ser-ADPr y sugiere que el sitio activo conservado debe ser responsable de la actividad de eliminación tanto de PAR como de Ser-ADPr.

Una representación esquemática de la arquitectura del dominio PARG. El dominio catalítico se compone de dos subdominios; un dominio accesorio (AD, amarillo) y un macrodominio (macro, rojo). Los límites de dominio se dan a continuación y el motivo EE catalítico (línea negra) arriba del diagrama. Abreviatura C. elegans PARG1, cPARG1; D. melanogaster Parg, dParg; Homo sapiens PARG, hPARG; Tetrahymena thermophila Parg, tParg. B Actividad de mutantes catalíticos de dParg y truncamientos C-terminales en hPARP1 automodificado con poli-Glu. Se obtuvo hPARP1 automodificado con poli-Glu como se describe en la Fig. 6C y posteriormente se complementó con dParg WT o con los mutantes indicados. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. C Actividad de mutantes catalíticos dParg y truncamientos C-terminales en péptido histona H3 mono-Ser-ADP-ribosilado purificado (aa 1–21). El péptido H3 de histona mono-Ser-ADP-ribosilado (aa 1-21) se obtuvo como se describe en Métodos y posteriormente se complementó con dParg WT o con los mutantes indicados. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares.

La caracterización previa de PARG identificó un bucle catalítico que contiene dos residuos absolutamente conservados (Glu755 y Glu756 en humanos) que son críticos para la eliminación de cadenas PAR (Fig. 8A, B y Fig. 6 complementaria)24. Mutamos los residuos de dParg correspondientes (Glu340 y Glu341) a aspartato y alanina para evaluar si estos mutantes conservarían su capacidad para eliminar mono-Ser-ADPr. Primero, evaluamos tanto WT como dParg mutante contra hPARP1 automodificado (Fig. 8B). Como era de esperar, estas mutaciones abolieron la actividad de dParg contra PAR. Del mismo modo, no pudimos detectar ninguna actividad de dParg contra la histona H3 mono-Ser-ADP-ribosilada (Fig. 8C). Estos datos muestran claramente que estas mutaciones anulan la actividad de dParg, lo que respalda la idea de que el mismo sitio activo es responsable de la eliminación de PAR y mono-Ser-ADPr y deja la pregunta de cómo dParg elimina mono-Ser-ADPr.

El descubrimiento de que el dominio catalítico dParg desarrolló actividad de eliminación de Ser-ADPr nos llevó a examinar si los homólogos de PARG de otros organismos podrían tener tal actividad. Probamos la actividad de los homólogos de PARG del ciliado Tetrahymena thermophila (tParg). En ausencia de HPF1, las variantes WT de todas las PARG analizadas pueden eliminar la PAR ligada al glutamato de la hPARP1 automodificada, pero dejan una sola banda correspondiente a mono-Glu-ADPr hPARP1 (Fig. 9A). La actividad se anuló en el mutante catalítico tParg E256Q. Curiosamente, tParg se comporta de manera similar a dParg con respecto a la eliminación de mono-Ser-ADPr del péptido H3 modificado, y esta actividad se perdió en el mutante catalíticamente muerto tParg E256Q (Fig. 9B). Estos ensayos confirmaron que la eliminación de mono-Ser-ADPr por las enzimas PARG no es exclusiva de Drosophila, sino un mecanismo compartido por al menos otro filo que carece de ARH3 (Fig. 1A).

A Actividad del homólogo de PARG de T. thermophila contra hPARP1 automodificado con poli-Glu. Se obtuvo hPARP1 poli-Glu-automodificado como se describe en la Fig. 6C. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. B Actividad de tParg en el péptido H3 de histona mono-Ser-ADP-ribosilado purificado (aa 1–21). El péptido H3 de histona mono-Ser-ADP-ribosilado (aa 1-21) se obtuvo como se describe en los Métodos. El experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares.

Para obtener información sobre la capacidad de dParg para eliminar Ser-ADPr, resolvimos dos estructuras del truncamiento catalíticamente activo dParg Δ574–723: la estructura apo se resolvió a una resolución de 2.47 Å (PBD 8ADK, Fig. 10A y Datos complementarios 2 ) y la estructura cocristalina con PARGi a una resolución de 2,51 Å (PDB 8ADJ, figura complementaria 7 y datos complementarios 2). Ambas estructuras son muy similares con los residuos 26 a 525 y 533–547 claramente visibles en la densidad electrónica y un RMSD de 0.139 Å sobre 369 Cα alineados. La estructura de dParg se compone de un pliegue de macrodominio central que alberga la hendidura de unión al sustrato predicha, así como los residuos catalíticos61,62. El macrodominio se extiende por un dominio accesorio altamente estructurado y conservado, de modo que el dominio general se compone de una hoja β retorcida, mixta, de diez hebras, flanqueada por dos subdominios predominantemente α-helicoidales (Fig. 8A). La estructura general de dParg es similar a otros PARG con RMSD de 0,586 Å sobre 381 Cα alineados para humanos (PDB 4B1G), 0,651 Å sobre 366 Cα alineados para ratón (mPARG; PDB 4FC2) y 1,816 Å sobre 255 Cα alineados para tParg (PDB 4EPP, Fig. 10B). De manera similar, el complejo dParg:PARGi se parece mucho a los complejos hPARG con inhibidores similares (RMSD de 0,514 Å sobre 374 Cα alineados para el PDD00017262 [PBD 5LHB] y 0,491 Å sobre 369 Cα alineados para el complejo PDD00017299 [PDB 6HML]). La unión de PARGi se superpone con la región de coordinación de adenosina dentro de la hendidura de unión al sustrato. La unión está estrechamente coordinada con interacciones escalonadas de apilamiento π entre Tyr380/Phe485 y el resto de 2,4-quinazolinediona (Fig. 7 complementaria), así como interacciones polares con la cadena principal de Ile311, Phe485 (Fig. 7 complementaria) y el cadenas laterales de Glu312, Gln339 y Phe485 (Fig. 7 complementaria). Es interesante notar que en el complejo hPARG:ADPr (PDB 4NA0) Phe902, que es isoestructural para dParg Phe485, se apila con el anillo de adenina, lo que requiere una rotación de la cadena lateral de ~90° en relación con la interacción de apilamiento del inhibidor. Esto muestra que la unión del inhibidor no solo compite por el espacio de unión, sino que también altera los contactos cruciales del sustrato.

Una representación de superficie de cinta de apo dParg. El dímero de ADP-ribosa (amarillo) de la estructura del complejo hPARG:ADP-dímero de ribosa alineado se proporciona para resaltar el sitio activo. Se destacan las características estructurales importantes para la catálisis: bucles de dominio accesorio 1 y 2, bucle AD 1 y 2; bucle catalítico, bucle 1; bucle de unión de difosfato, bucle 2; cierre de tirosina, bucle de Tyr. B Representación en cinta de la alineación estructural de los dominios PARG de las especies indicadas (Drosophila, rojo; humano, amarillo; ratón, naranja; T. thermophile, blanco). Los residuos catalíticos (Glu340/Glu341 en dParg) están resaltados en negro. C Representación de cinta-regaliz de la interacción bucle 1-AD-bucle 1 de PARG de Drosophila, humano y T. thermophile. Las interacciones polares se destacan como líneas punteadas negras y las moléculas de agua involucradas en la interacción como esferas rojas.

La comparación de dParg con las estructuras hPARG y mPARG de mamíferos, así como con estructuras tParg de protozoos, muestra una arquitectura de sitio activo casi idéntica (Fig. 9B). La posición del bucle catalítico (bucle 1) es isoestructural en las estructuras comparadas, mientras que se sabe que el bucle de unión de difosfato (bucle 2) sufre un reordenamiento conformacional al unirse al sustrato (Fig. 10B y Figs. 7 y 8 complementarias y Tabla complementaria 1)63,64. El bucle 2 parece cristalizarse en la posición abierta y se parece mucho a la estructura apo mPARG (Fig. 8 complementaria). En la estructura del complejo mPARG:ADPr (PDB 4NA0), el bucle se mueve ligeramente hacia la hendidura de unión al sustrato, lo que permite que los átomos de nitrógeno de la cadena principal de Gly866 y Ala867 interactúen con los átomos de oxígeno de fosfato de la ADP-ribosa. La unión del sustrato se acompaña además del reposicionamiento de Phe868 (Phe458 en dParg) e His821 (His413 en dPARG), que se desplazan de la hendidura de unión y contribuyen a la coordinación de la ribosa distal (Fig. 7 complementaria). Estos hallazgos sugieren que no existen diferencias estructurales importantes en la coordinación del resto ADP-ribosa o la ubicación de los residuos catalíticos y sugieren diferencias sutiles entre los PARG que pueden eliminar el enlace terminal Ser-ADPr y los que no.

Finalmente, investigamos las características estructurales adyacentes al bucle 1: se identificaron dos bucles ubicados dentro del dominio accesorio que apoyan tanto el posicionamiento del bucle 1 como la interacción accesoria-macrodominio (denominada AD-bucle 1 y 2; Fig. 10A, B y Fig. Suplementaria). 6). La interacción bucle 1: AD-bucle 1 está estabilizada por una red de agua extendida en hPARG (Fig. 10C). Sin embargo, estas interacciones se reducen notablemente en dParg, mientras que AD-loop 1 está ausente en tParg (Fig. 10C). La principal diferencia en la red de coordinación entre loop1 y AD-loop 1 es la presencia de un residuo de treonina (Thr748 en hPARG, mientras que tanto dParg como tParg contienen un residuo de leucina (Leu333 y Leu248, respectivamente) en la posición isoestructural. Nuestro análisis filogenético mostró que la treonina se conserva dentro de Mammalia y la leucina se puede encontrar en Diptera, Nematoda y Protozoa (Fig. 6 complementaria), lo que sugiere que de hecho es un factor en la especificidad del sustrato. Sin embargo, la distancia desde el motivo EE catalítico como así como su orientación lejos del sustrato (Fig. 10A) sugiere que no hay participación directa en el mecanismo catalítico.

La ribosilación de ADP ligada a serina es un mecanismo de señalización crucial en la DDR de humanos y otras especies de mamíferos. Aquí proporcionamos evidencia de que esta variante de señalización se extiende por todo Animalia y puede ser una característica definitoria de la regulación DDR de este reino. Utilizando espectrometría de masas de última generación, proporcionamos un primer borrador del ribosiloma ADP de Drosophila que identifica > 500 sitios ADPr de alta confianza. Anteriormente, se ha informado que ADPr modifica los residuos de ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y arginina52,65,66. El descubrimiento relativamente reciente de residuos de serina como sitios aceptores13 ha llevado a la identificación de la serina como el residuo de aminoácido más abundantemente modificado bajo daño en el ADN en cultivo celular12,14. Al combinar la estrategia de enriquecimiento Af1521, que es capaz de identificar ADPr en todos los residuos de aminoácidos posibles50,67,68, con la fragmentación de ETD para la localización adecuada del sitio de modificación12, identificamos la serina como el residuo modificado más abundantemente en Drosophila en estas condiciones experimentales . Aún así, las condiciones experimentales, así como la profundidad de la secuenciación, podrían causar la ausencia de otros residuos aceptores de aminoácidos conocidos. Nuestro análisis del ciclo Ser-ADPr en D. melanogaster reveló además una sorprendente conservación con la vía de señalización humana. A nivel molecular, no solo se conserva el motivo de consenso de ADPr de mamíferos 'KS', sino que observamos una amplia superposición con objetivos de ADPr previamente identificados en humanos. Esto es particularmente cierto para los principales aceptores de ADP-ribosa como PARP1 e histonas. En ambas especies, las vías relevantes para la estabilidad del genoma, la regulación de la estructura de la cromatina y la transcripción son los principales objetivos de esta modificación. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que Drosophila puede servir como organismo modelo para proporcionar información sobre la función fisiológica de la señalización de Ser-ADPr. Esto incluye la posibilidad de comprender los vínculos entre esta modificación y enfermedades asociadas, incluida la neurodegeneración y el cáncer30,41,69,70,71. En este sentido, previamente se demostró que la deficiencia de dParg podría complementarse utilizando el gen ARH3 humano71. Además, como la región de automodificación de hPARP1 que ha demostrado ser importante para atrapar hPARP1 en roturas de ADN y la respuesta del inhibidor de PARP en humanos se conserva funcionalmente en especies de Drosophila (Fig. 4G y Fig. 4 complementaria), este modelo podría ser útil para comprender los efectos fisiológicos de los inhibidores de PARP clínicamente relevantes30.

Nuestro análisis filogenético destaca que entre las especies portadoras de HPF1, ARH3 está ausente en Protozoa, Nematoda, Lepidoptera y Diptera. Por el contrario, ARH3 se puede identificar en la mayoría de los animales, incluidos los basales de los filos Placozoa, Porifera o Cnidaria. Este patrón de presencia y ausencia de ARH3 sugiere fuertemente una historia evolutiva que (i) contiene una ganancia de ARH3 en la evolución temprana de Animalia y (ii) al menos dos eventos de pérdida independientes: primero en la división entre Nematoda y Arthropoda, y segundo durante la diversificación dentro del superorden Endopterygota. Curiosamente, PARP2, que en humanos también puede generar Ser-ADPr, también está ausente en Drosphila. Por lo tanto, parece que Drosophila, a pesar de la conservación de la función fisiológica, utiliza solo un sistema Ser-ADPr mínimo para la regulación de DDR que consiste en dHPf1, dParp como el único PARP de reparación de ADN (aunque con arquitectura de dominio hPARP1), así como dParg, que combina la actividad de poli- y mono-Ser-(ADP-ribosil)hidrolasa. Dadas las similitudes funcionales, esto puede ser ventajoso para algunos estudios, ya que permite una manipulación más sencilla del establecimiento y la eliminación de la señal. Además, nuestro estudio reveló que las herramientas desarrolladas para el estudio y la aplicación clínica de Ser-ADPr humana, como los reactivos de detección de ADPr y los anticuerpos, así como los inhibidores, se pueden aplicar al estudio de la señalización de ADPr en Drosophila. Nuestros datos estructurales revelaron que el sitio activo de dParg se conserva con respecto a los PARG de mamíferos y protozoos, lo que indica que la diferencia en la actividad no es el resultado de un mecanismo catalítico alterado. Juntos, nuestros datos sugieren que la capacidad de escindir el enlace Ser-ADPr se basa en diferencias estructurales sutiles que rodean el sitio activo que pueden (no) permitir el acceso de ciertos sustratos. Esta idea está respaldada por las diferencias en la geometría del sustrato. Los datos estructurales de un dímero de ADP-ribosa en complejo con hPARG (PDB 5A7R) indican que la unidad n-1 se extiende linealmente fuera del sitio activo (Fig. 10A). Por el contrario, el péptido modificado con serina cocristalizado con hARH3 (PDB 7AKS) se encuentra perpendicular al bolsillo de unión de ADP-ribosa. Sin embargo, se necesitan más estudios para discernir el modo de interacción de diferentes PARG con sus diversos sustratos. Sobre la base de nuestros hallazgos filogenéticos y bioquímicos, es interesante especular que la capacidad de las PARG para escindir el enlace terminal proteína-ribosa puede no estar limitada a las moscas de la fruta. Esto está respaldado por (i) la identificación de varias ramas evolutivas que llevan HPF1, pero carecen de ARH3 (Fig. 1), (ii) nuestra confirmación experimental de que tParg también puede eliminar Ser-ADPr (Fig. 9) así como (iii ) observaciones recientes en plantas que muestran que Arabidopsis thaliana Parg1 puede eliminar mono-ADPr de SZF172. En particular, se han descrito duplicaciones del gen PARG tanto en plantas como en C. elegans73,74, lo que es indicativo de una diversificación de los sistemas de señalización de ADPr conocidos que pueden contener nuevas sorpresas para futuros descubrimientos.

La línea celular de Drosophila S2R+ se compró en DGRC (https://dgrc.bio.indiana.edu/Home) y se cultivó en medio de Drosophila Schneider (21720-024, Gibco) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (10500 -056, Gibco) y penicilina-estreptomicina al 1% (100 U/ml, 15140-122, Gibco) a 25 °C y pases cada 3-4 días. La línea celular de osteosarcoma humano U2OS se adquirió en ATCC (HTB-96) y se cultivó en DMEM (10566016, Gibco) suplementado con FBS al 10 % (F9665, Sigma) y penicilina-estreptomicina (100 U/ml, GIBCO) a 37 °C. C con 5% de CO2 y pasadas cada 3-4 días. Para todos los experimentos de inducción de daños en el ADN, las células se sembraron a una densidad de 5 × 106 células para células S2R+ o 2 × 106 células para células U2OS en una placa de 6 cm. Al día siguiente, las células se lavaron una vez cuidadosamente con PBS y se dañaron con H2O2 2 mM (H1009, Sigma) o MMS 5 mM (129925, Sigma) en PBS más calcio y magnesio (DPBS, Gibco, 14040-133) durante los tiempos indicados. Para el tratamiento del inhibidor de PARG, se sembraron 5 × 106 células en una placa de 6 cm. Al día siguiente, las células se trataron con inhibidor de PARG 2 μM (PDD00017273, Sigma) durante 16 h, mientras que las células de control se trataron con DMSO. Esto fue seguido por el tratamiento con H2O2 como se describe anteriormente.

Las células se lisaron en TrisHCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM y Triton X-100 al 1 % (v/v), MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, complementado con inhibidor de proteasa 1x (Roche), PARG 1 μM inhibidor (PDD00017273, Sigma) e inhibidor de PARP 1 μM (Olaparib, LKT LABS). Los lisados ​​se incubaron con benzonasa al 0,1 % (Sigma) durante 30 min a 4 °C. La fracción soluble se mezcló con tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen) con DTT 50 mM y las proteínas se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 min. Los extractos celulares completos de las células S2R+ se separaron electroforéticamente en geles NuPAGE Novex 4–12 % Bis-Tris (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) durante 30 min utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Las membranas transferidas se bloquearon con tampón PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % (v/v) y leche desnatada en polvo al 5 % (p/v) durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron con anticuerpo anti-poli ADPr de conejo (4336-BPC- 100, Trevigen, 1:1,000, RRID: AB_2721257), reactivo anti-poli ADPr de conejo (MABE1031, Millipore, 1:500, RRID: AB_2665467), reactivo anti-pan ADPr de conejo (MABE1016, Millipore, 1:1,000, RRID: AB_2665466), anticuerpo anti-mono ADPr de conejo (MABE1076, Millipore, 1:500, RRID: AB_2665469), anticuerpo anti-mono ADPr de conejo (AbD33204, BioRad, 1:1,000), histona H2AvD anti-fósforo de conejo (Ser137) ) anticuerpo (600-401-914, Rockland, 1:3,000, RRID: AB_828383), anticuerpo de ratón anti-fósforo Histona H2A.X (Ser139) (clon JBW301, 05-636, Millipore, 1:500, RRID: AB_309864) o anticuerpos monoclonales anti-actina de ratón (JLA20, concentración, Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:10 000, RRID: AB_528068) a 4 °C durante la noche. Después de lavar con PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % (v/v), las transferencias se incubaron con una IgG anti-conejo marcada con peroxidasa de rábano picante (P0399, Dako, 1:4000, RRID: AB_2617141) o una IgG anti-ratón (P0447, Dako, 1:4000, RRID: AB_2617137) durante 1 h. La detección se realizó utilizando sustrato de transferencia Western Pierce ECL (Thermo Scientific) y se analizó mediante luminografía utilizando Hyperfilm ECL (Amersham). Los experimentos se realizaron durante un mínimo de tres repeticiones independientes.

Los péptidos ribosilados con ADP se lisaron y enriquecieron como se describe anteriormente, ref. 12, 51, 75. En resumen, los gránulos celulares se lisaron en 10 volúmenes de gránulos de tampón de lisis (clorhidrato de guanidina 6 M, TrisHCl 50 mM [pH 8,5]), y se logró la lisis completa alternando agitación vigorosa con agitación vorticial vigorosa. Tras la reducción y la alquilación con TCEP y CAA, las proteínas se digirieron con lisil endopeptidasa (Lys-C, 1:100 p/p; Wako Chemicals) durante 3 h y se diluyeron con tres volúmenes de bicarbonato de amonio 50 mM. Las muestras se digirieron adicionalmente durante la noche usando tripsina de grado de secuenciación modificada (1:100 p/p; Sigma Aldrich). Las muestras digeridas se purificaron utilizando cartuchos C18 de fase inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La elución de los péptidos se realizó con ACN al 30 % en TFA al 0,1 %, los péptidos se congelaron durante la noche a -80 °C y luego se liofilizaron durante 96 h.

Los péptidos liofilizados se disolvieron en tampón AP (TrisHCl 50 mM [pH 8,0], MgCl2 1 mM, DTT 250 μM y NaCl 50 mM), y se usaron ~2 mg de péptido para cada experimento repetido. Las muestras se incubaron con Af1521 y se dejaron girando cabeza sobre cola a 4 °C durante 4 h. Las perlas se lavaron dos veces en tampón AP enfriado con hielo recién preparado, dos veces en PBS enfriado con hielo con DTT y dos veces en agua MQ enfriada con hielo, con un cambio de tubo cada vez que se cambiaba el tampón. Los péptidos modificados con ADPr se eluyeron de las perlas mediante la adición de TFA al 0,15% enfriado con hielo. Los péptidos eluidos se pasaron a través de filtros giratorios de 0,45 μm y luego a través de filtros giratorios prelavados de corte de 100 kDa (Vivacon 500, Satorius), después de lo cual se fraccionaron a pH alto en tres fracciones y un F012,50,51,53 adicional. .

Todos los experimentos de MS se analizaron en un sistema HPLC EASY-nLC 1200 (Thermo) conectado a un espectrómetro de masas Fusion Lumos Orbitrap (Thermo). Cada muestra se separó en una columna analítica de 15 cm, con un diámetro interno de 75 μm, se empaquetó internamente con perlas C18 de 1,9 μm (ReproSil-Pur-AQ, Dr. Maisch) y se calentó a 40 °C en un horno de columna. . La separación de péptidos se realizó usando un gradiente de 60 min a una velocidad de flujo de 250 nL/min, utilizando tampón A que constaba de 0,1 % de FA y tampón B que constaba de 80 % de ACN en 0,1 % de FA. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de adquisición dependiente de datos, con exploraciones completas realizadas a una resolución de 120 000 y un tiempo de inyección máximo de 250 ms. La fragmentación de precursores se logró mediante disociación por transferencia de electrones con disociación de colisión superior suplementaria (EThcD), con energía de activación suplementaria de 20. Se incluyeron precursores con estado de carga 3-5 y se priorizaron desde la carga 3 (más alta) a la carga 5 (más baja), usando el algoritmo del árbol de decisión. Los precursores seleccionados se excluyeron de la secuenciación repetida estableciendo una exclusión dinámica de 45 s. Los espectros MS/MS se midieron en el Orbitrap, con un tiempo máximo de inyección de precursor de 500 ms y una resolución de exploración de 60.000. Todos los datos sin procesar de MS se analizaron con el paquete de software MaxQuant, versión 1.5.3.3076, y se buscaron en el proteoma de Drosophila en formato de archivo FASTA, tal como se descargó de UniProt el 11 de noviembre de 2020. Se usaron las configuraciones predeterminadas de MaxQuant, excepto las siguientes: carbamidometilación de cisteína, y ADP-ribosilación en residuos de cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, lisina, arginina, serina, treonina y tirosina se incluyeron como modificaciones variables. La puntuación delta de Andrómeda se fijó en un mínimo de 20 para los péptidos modificados.

El manejo estadístico de los datos se realizó principalmente utilizando el software Perseus disponible gratuitamente77 e incluye análisis de componentes principales y análisis de gráficos de volcanes. Las anotaciones de ontología de genes de proteínas se realizaron utilizando DAVID Bioinformatics Resources78. El análisis del contexto de la secuencia se realizó utilizando el software iceLogo79.

El análisis de interferencia de ARN se llevó a cabo como se describió previamente en la ref. 80, 81. Los nucleótidos 34–367 del ADNc de dParg se eligieron como objetivos de dsPARG-1 utilizando SnapDragon (https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl). Los objetivos de dsPARG-2 (769-1275) y dsLacZ se produjeron como se describió previamente en la ref. 32. Los oligonucleótidos para generar plantillas para dsRNA por PCR se proporcionan en Datos complementarios 3. Los dsRNA se prepararon utilizando el kit MEGAscript T7 (Thermo Fisher Scientific, AM1334) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se desnaturalizó a 65 °C durante 30 min y luego se recoció enfriándolo lentamente hasta 4 °C. Se agregaron 10 μg de dsRNA por 1 × 106 células. Las células se recolectaron durante 5 días después del tratamiento con dsRNA, seguido de la inducción del daño en el ADN usando H2O2 como se describe anteriormente o el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR) como se describe a continuación.

Los ARN totales de las células S2R+ se purificaron con el kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN) y luego se usaron 0,5 μg de ARN total para la síntesis de ADNc con el kit de transcripción inversa QuantiTect de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cDNA se detectaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit y el Rotor-Gene Q (QIAGEN). Los pares de cebadores para RT-qPCR se proporcionan en Datos complementarios 3. El análisis de expresión génica relativa del gen dParg se realizó mediante el método ddCt.

Se utilizó Prism 9.1 (GraphPad) para el análisis estadístico, donde ****p < 0,0001. Los detalles de los análisis estadísticos se describen en la leyenda de la Fig. 4.

Los vectores de expresión para hARH3, hTARG1, hHPF1, hPARP1 y hPARG se describieron anteriormente5,15,54,63. La secuencia de codificación de dParp, dParg, dTarg1-3 y dHpf1 se amplificó a partir de ADNc preparado a partir de células S2R+ utilizando los oligonucleótidos enumerados en Datos complementarios 3 y se clonó en plásmidos de expresión pET28a con una etiqueta His N-terminal. Todas las mutaciones indicadas se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR (Datos complementarios 3). La expresión se llevó a cabo en células E. coli Rosetta (DE3) (Novagen) y medio Terrific Broth suplementado con 30 μg/ml de kanamicina y 30 μg/ml de cloranfenicol. Las células se cultivaron a 37 °C y el crecimiento se detuvo cuando el cultivo alcanzó una DO600 ~ 0,6. A continuación, los cultivos se indujeron con IPTG 1 mM y se incubaron a 18 °C durante la noche. Las células se centrifugaron durante 10 min a 3000 x g, y los sedimentos se resuspendieron en tampón A (TrisHCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, TCEP 1 mM, imidazol 10 mM) complementado con un cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA completo 1x (Roche ) y 250 U de benzonasa nucleasa (Sigma) por 1 L de cultivo celular. Todos los siguientes pasos de purificación se realizaron a 4 °C. La lisis se realizó utilizando un homogeneizador y los restos celulares se separaron mediante centrifugación a 35.000 x g durante 60 min. Luego, el sobrenadante se incubó con resina Ni-NTA (Qiagen) preequilibrada con tampón A, durante 30 min. La suspensión se transfirió a una columna de flujo por gravedad vacía (BioRad) y la resina se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón A antes de la elución con tampón A suplementado con imidazol 300 mM. Las proteínas eluidas se dializaron frente a TrisHCl 25 mM (pH 8), NaCl 500 mM y DTT 1 mM a 4 °C, durante la noche. Luego, las proteínas se concentraron y se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna HiLoad 16/60 Superdex 75 equilibrada con TrisHCl 10 mM (pH 8), NaCl 100 mM, TCEP 0,2 mM para dParg y dTarg1-3, o TrisHCl 10 mM (pH 8). pH 8), NaCl 100 mM, TCEP 0,1 mM para dTarg1-3 y dHpf1, respectivamente. dParg y dTarg1-3 eluidos se concentraron a 8 mg/ml y dHpf1 a 9 mg/ml. La calidad de la proteína se evaluó para cada paso mediante SDS-PAGE. Todas las demás proteínas se expresaron y purificaron como se describió anteriormente: hPARG62, hHPF115, hPARP1 de tipo salvaje y el mutante E988Q82, hARH1, hARH2, hARH383 e histona H3/H484. El péptido histona H3 (aa 1–21) se adquirió de Sigma (SaintLouis, MO, EE. UU.).

La ADPr se realizó como se describió previamente25. Brevemente, las proteínas o péptidos recombinantes fueron ribosilados con ADP por hPARP1 para producir Glu-ADPr o por hPARP1:hHPF1 para producir Ser-ADPr. Las reacciones se realizaron en TrisHCl 50 mM (pH 8), NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, ADN activado y NAD+ 50 µM enriquecido con 32P-NAD+. La reacción de hPARP1 se realizó a temperatura ambiente durante 30 min y se detuvo mediante la adición de olaparib 1 µM. Las proteínas ADP-ribosiladas se usaron como sustrato para los sucesivos ensayos de (ADP-ribosil)hidrolasa. El sustrato se incubó a temperatura ambiente durante 30 min con las (ADP-ribosil)hidrolasas indicadas y se analizó mediante SDS-PAGE y autorradiografía. Las concentraciones de hPARP1 y hHPF1 por reacción fueron 0,5 μM, (ADP-ribosil) hidrolasa fue 1 μM, tetrámero de histona H3/H4 2 μM y péptidos de histona 0,5 μg.

El ensayo se realizó como se describió previamente58,59,60. Brevemente, la concentración del péptido sintético mono-Ser-ADPr H2B59 se estimó utilizando la absorbancia a λ260nm con un coeficiente de extinción molar de 13.400 M-1 cm-1 para la modificación de ADP-ribosilo. El péptido 8 μM se desmodificó mediante incubación con hidrolasa indicada 1 μM durante 30 min a 30 °C en tampón de ensayo (TrisHCl 50 mM [pH 8], NaCl 200 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM y NudT585 humano 0,2 μM). Las reacciones se detuvieron y analizaron realizando el ensayo AMP-Glo™ (Promega) según el protocolo del fabricante. La luminiscencia se registró en un lector de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) y los datos se analizaron con GraphPad Prism 9.1. Para la reacción de sustracción de fondo se llevó a cabo en ausencia de hidrolasa.

El péptido histona H3 se ribosiló con Ser-ADP como anteriormente, excepto que se usaron concentraciones más altas de sustrato. Los péptidos ribosilados con ser-ADP se purificaron adicionalmente filtrando la reacción usando una columna de concentración con un límite de 10 kDa (Millipore). El exceso de NAD+ se eliminó utilizando una columna giratoria G25 (GE HealthCare, Reino Unido).

Se generaron alineaciones de secuencias de HPF1 de especies de metazoos y protozoos (datos complementarios 1) con JalView v. 2.1186 y el dominio de HPF se extrajo de su contexto secuencial en función de la alineación87 de Mafft L-INS-i utilizando datos cristalográficos para determinar los límites del dominio. Las secuencias extraídas se realinearon utilizando el algoritmo Mafft L-INS-i. Las historias evolutivas del dominio HPF se infirieron utilizando el método de máxima verosimilitud y el modelo Le_Gascuel_200888 con un árbol inicial obtenido automáticamente para la búsqueda heurística aplicando el método de máxima parsimonia. El análisis se realizó utilizando una cobertura de sitio del 95% con opción de borrado parcial. Los niveles de confianza se estimaron utilizando 1000 ciclos del método bootstrap. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA1189.

Las alineaciones de las secuencias PARP y PARG (Tablas complementarias 1 y 3) se generaron utilizando JalView v. 2.11 utilizando el algoritmo Mafft L-INS-i implementado.

Los ensayos de cristalización se realizaron a 4 °C con pantallas comerciales usando el método de difusión de vapor con la ayuda de un robot Mosquito Crystal (TTP Labtech) usando gotas sentadas de 150 nl de solución de proteína en microplacas de cristalización de dos pocillos MRC (Swissci) equilibradas con 150 nl reservorio. Se cultivaron cristales de dParg en PEG3350 al 19% (p/v), sulfato de sodio 210 mM, propano Bis-Tris 0,1 M (pH 7,2). Los cristales de dParg en complejo con el inhibidor PDD00017273 crecieron en las mismas condiciones, excepto que se añadió PDD00017273 a la solución de proteína a una concentración de 0,5 mM antes de la cristalización. Todos los cristales fueron crioprotegidos en glicerol al 15% (v/v) en las aguas madres antes de ser vitrificados por inmersión en nitrógeno líquido. La recopilación de datos se realizó en las líneas de luz I04 e I24 de Diamond Light Source (Laboratorio Rutherford Appleton, Harwell, Reino Unido).

Los datos de rayos X se procesaron utilizando Xia290. PHASER91 se utilizó para ensayos de reemplazo molecular con hPARG (PDB: 6HMK) como modelo de reemplazo molecular. La modificación de la densidad se realizó con PARROT92 y los modelos iniciales se construyeron utilizando el programa de construcción de modelos automatizado BUCCANEER93. La construcción de modelos para todas las estructuras se llevó a cabo con COOT94 y el refinamiento del espacio real con REFMAC595, junto con restricciones de simetría no cristalográfica locales generadas automáticamente y refinamiento TLS. Las estadísticas para el complejo dParg y dParg:PDD00017273 se muestran en la Tabla complementaria 2.

Las células de Drosophila S2R+ se sembraron en un portaobjetos de cámara ibiTreat de 8 pocillos (ibidi) y se transfectaron 48 h antes de la obtención de imágenes usando FugeneHD de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la sensibilización celular antes de la irradiación con láser a 405 nm, se aspiró el medio de crecimiento del portaobjetos de la cámara y se reemplazó con medio nuevo que contenía 0,3 μg/ml de Hoechst 33342. Inmediatamente antes de la obtención de imágenes, el medio que contenía Hoechst se reemplazó con medio de crecimiento nuevo. La microscopía de células vivas se llevó a cabo en un microscopio invertido Olympus IX-83 equipado con un cabezal de disco giratorio de superresolución Yokogawa SoRa, un objetivo de inmersión en aceite UPlanAop 60x/1,5 NA para experimentos de microirradiación, un UPlanXApo 100×/1,35 NA para experimentos de localización de proteínas y una cámara Prime BSI sCMOS. La fluorescencia de Hoechst y EGFP se excitó con láser de estado sólido de 405 nm y 488 nm respectivamente y la detección de fluorescencia se logró con filtros de paso de banda adaptados a los espectros de emisión de fluoróforo. La microirradiación láser a 405 nm se realizó a lo largo de una línea de 7 µm a través del núcleo durante 250 ms utilizando un cabezal de exploración de un solo punto (Olympus cellFRAP) acoplado al tablero de epifluorescencia del microscopio. Para garantizar la reproducibilidad, se midió la potencia del láser a 405 nm al comienzo de cada experimento y se ajustó a 110 µW al nivel de la muestra. Para los experimentos de curso de tiempo, las imágenes se recolectaron cada 2 s. Para los experimentos de imágenes de células vivas, las células se mantuvieron a 25 °C con una cámara de calentamiento. A continuación, se calculó la acumulación de proteína en los sitios de daño (Ad) como:

A continuación, se normalizó la intensidad dentro del área microirradiada a la intensidad anterior a la inducción del daño.

Para las imágenes de localización de proteínas, se incubaron células de Drosophila S2R+ transfectadas con proteínas etiquetadas con EGFP en medios que contenían 1 μg/mL de Hoechst 33342 durante 30 min. El medio que contenía Hoechst se reemplazó con medio de crecimiento fresco antes de la toma de imágenes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas incluidas en el estudio han sido depositadas en el Protein Data Bank (PDB) con los siguientes códigos de acceso: apo dParg, 8ADK [https://doi.org/10.2210/pdb8adk/pdb]; complejo dParg:PARGi, 8ADJ [https://doi.org/10.2210/pdb8adj/pdb]. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE96 con el identificador de conjunto de datos PXD036512. Las imágenes completas de las manchas y el gel, así como los datos utilizados para generar gráficos, se pueden encontrar en el archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Todas las construcciones generadas en este estudio están disponibles a pedido y serán cumplidas por el contacto principal con un acuerdo de transferencia de materiales completado.

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Agradecemos a Luca Palazzo por brindarnos un valioso asesoramiento técnico, a Andrea Mikoč por sus comentarios críticos sobre el manuscrito y a Diamond Light Source por acceder a las líneas de luz I04 e I24 (números de propuesta mx12346 y mx18069). También agradecemos a Alan Wainman y al Centro de imágenes biológicas de la Escuela Dunn por el asesoramiento de expertos y el acceso al microscopio confocal. OS fue apoyado por el Programa de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) para el Avance de las Redes Internacionales Estratégicas para Acelerar la Circulación de Investigadores Talentosos (S2802). El trabajo en el laboratorio de MLN fue apoyado en parte por el Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, la Fundación Novo Nordisk (NNF14CC0001 y NNF13OC0006477), el Consejo Danés de Investigación Independiente (0135-00096 A, 2034-00311 A y 2032-00311 A), y la Sociedad Danesa del Cáncer (R325-A18824). La tecnología de proteómica aplicada formaba parte de un proyecto que recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención EPIC-XS-823839. El trabajo en el laboratorio de IA fue apoyado por Wellcome Trust (101794 y 210634); Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/R007195/1); Alianza para la Investigación del Cáncer de Ovario (813369); y Cancer Research Reino Unido (C35050/A22284).

Marcin J. Suskiewicz

Dirección actual: Centro de Biofísica Molecular, UPR4301 CNRS, rue Charles Sadron, CEDEX 2, F-45071, Orléans, Francia

Antonio Ariza

Dirección actual: Escuela de Biociencias, Universidad de Sheffield, Western Bank, Sheffield, S10 2TN, Reino Unido

Johannes Gregor Matthias Rack

Dirección actual: Centro MRC de Micología Médica, Facultad de Biociencias, Universidad de Exeter, Edificio Geoffrey Pope, Exeter, EX4 4QD, Reino Unido

Estos autores contribuyeron igualmente: Pietro Fontana, Sara C. Buch-Larsen, Osamu Suyari.

Escuela de Patología Sir William Dunn, Universidad de Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3RE, Reino Unido

Pietro Fontana, Osamu Suyari, Rebecca Smith, Marcin J. Suskiewicz, Kira Schützenhofer, Antonio Ariza, Johannes Gregor Matthias Rack e Ivan Ahel

Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Pedro Fontana

Programa en Medicina Celular y Molecular, Boston Children's Hospital, Boston, MA, EE. UU.

Pedro Fontana

Programa de proteómica, Centro de Investigación de Proteínas de la Fundación Novo Nordisk, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Copenhague, Blegdamsvej 3B, 2200, Copenhague, Dinamarca

Sara C. Buch-Larsen y Michael L. Nielsen

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PF, SCB-L., OS, MJS, JGMR, MLN e IA concibieron el estudio. PF diseñó y realizó los estudios bioquímicos. SCB-L. adquirido y analizado los datos espectrométricos de masas. OS realizó los experimentos de biología celular y los estudios de apoyo de biología celular de KS. RS realizó experimentos de microscopía. PF, MJS y AA resolvieron las estructuras cristalinas. JGMR realizó el análisis filogenético, apoyó los análisis e interpretación de datos, PF, SCB-L., OS, AA, JGMR, MLN e IA escribieron el manuscrito, con contribuciones de todos los autores.

Correspondencia con Antonio Ariza, Johannes Gregor Matthias Rack, Michael L. Nielsen o Ivan Ahel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Georges Mer y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Fontana, P., Buch-Larsen, SC, Suyari, O. et al. Serina ADP-ribosilación en Drosophila proporciona información sobre la evolución de la señalización de ADP-ribosilación reversible. Nat Comun 14, 3200 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

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Recibido: 14 Septiembre 2022

Aceptado: 16 mayo 2023

Publicado: 02 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

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