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Sep 08, 2023

Actividad antibacteriana de vB

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7470 (2023) Citar este artículo

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Las enzimas líticas de fago son agentes antimicrobianos prometedores. En este estudio, se identificó una endolisina derivada de vB_AbaM_PhT2 (vPhT2). Esta endolisina representaba el dominio de lisozima conservado. La endolisina recombinante (lysAB-vT2) y la endolisina de fusión hidrófoba (fusión de lysAB-vT2) se expresaron y purificaron. Ambas endolisinas mostraron actividad lítica contra la pared celular cruda bacteriana de bacterias Gram-negativas. La MIC de lysAB-vT2-fusion fue de 2 mg/ml correspondiente a 100 µM, mientras que la MIC de lysAB-vT2 fue superior a 10 mg/ml (400 µM). La combinación de fusión de lysAB-vT2 con colistina, polimixina B o cobre fue sinérgica frente a A. baumannii (valor FICI de 0,25). La actividad antibacteriana de la fusión lysAB-vT2 más colistina en las concentraciones inhibitorias fraccionarias (FIC) reveló que puede inhibir Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y varias cepas de A. baumannii extremadamente resistente a los medicamentos (XDRAB) y A. baumannii resistente a los fagos. La fusión lysAB-vT2 aún conservaba su actividad antibacteriana después de incubar la enzima a 4, 20, 40 y 60 °C durante 30 min. La fusión lysAB-vT2 podría inhibir la biopelícula madura, y la incubación de la fusión lysAB-vT2 con células humanas T24 infectadas con A. baumannii condujo a una reducción parcial de la liberación de LDH de las células T24. En resumen, nuestro estudio destaca la capacidad antimicrobiana de la endolisina de fusión lysAB-vT2 diseñada, que se puede aplicar para el control de la infección por A. baumannii.

Acinetobacter baumannii es una bacteria Gram-negativa que emerge como una de las principales causas de infección nosocomial y es particularmente problemática para los pacientes con asistencia respiratoria con estadías prolongadas en el hospital. Las asociaciones con una incidencia cada vez mayor de A. baumannii resistente a los medicamentos, que resisten el tratamiento con el último recurso antibiótico colistina, han impulsado la investigación de nuevos agentes antimicrobianos. Un candidato potencial es la terapia con fagos, que utiliza bacteriófagos líticos o enzimas de fagos para tratar infecciones bacterianas que son resistentes a los antibióticos1,2. Sin embargo, existen limitaciones en el uso de viriones de fagos, incluida la especificidad de los fagos para un rango de huéspedes reducido y el potencial para el desarrollo de resistencia3. Nuestro estudio anterior mostró que el 50 % de los aislamientos de A. baumannii en Tailandia eran cepas resistentes a los fagos contra 17 fagos líticos de A. baumannii probados4. Por lo tanto, existe un interés creciente en el uso de enzimas líticas de bacteriófagos, o endolisinas, como agentes antimicrobianos en comparación con el uso de viriones de fagos. Las endolisinas son enzimas de fagos que funcionan hidrolizando la capa de peptidoglicano, lo que provoca una caída repentina de la presión de turgencia y la lisis osmótica, lo que provoca la muerte de las células bacterianas5. Se han clonado, expresado y caracterizado endolisinas recombinantes de varios fagos de A. baumannii6,7,8,9,10,11,12,13,14. Yuan et al. y Kim et al. mostró que las endolisinas, Abtn-4 y LysSS, exhibieron una amplia actividad antimicrobiana contra varias bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Además, se observó que las endolisinas LysAB3, Abtn-4 y Abp013 son eficaces para reducir el biofilm de A. baumannii9,13,14. La actividad de las endolisinas como LysABP-01, ABgp46, LysMK34 y ElyA1 se puede mejorar combinándolas con permeabilizadores de la membrana externa, como ácidos orgánicos7 y colistina8,10,11. Además, se ha demostrado que las endolisinas diseñadas tienen una actividad antibacteriana mejorada contra las cepas de A. baumannii resistentes a la colistina15.

En un estudio anterior, identificamos vB_AbaM_PhT2 que mostró la mejor eficacia contra su huésped y varias cepas de A. baumannii. Este bacteriófago también mostró sinergia con la colistina16. Se realizó un análisis genómico de vB_AbaM_PhT2 utilizando la secuenciación de próxima generación (NGS) y permitió la identificación de genes putativos que codifican lisina. Estas enzimas hidrolizan el peptidoglicano en las paredes celulares bacterianas y, por lo tanto, son buenas candidatas como alternativas a los antibióticos. Aunque se han caracterizado muchas endolisinas en A. baumannii, hay menos estudios sobre el papel de la endolisina de fusión de aminoácidos hidrofóbicos. La capacidad de lisis de la endolisina de E. coli se mejoró mediante la adición de un aminoácido hidrofóbico en el extremo C-terminal de la endolisina17. Por lo tanto, nuestro objetivo fue investigar la actividad antimicrobiana de las endolisinas de fagos recombinantes y las endolisinas de fusión hidrofóbicas y su sinergia potencial con antibióticos, desinfectantes, metales pesados ​​y fagos. Las endolisinas de fusión mostraron una alta actividad lítica en comparación con la enzima nativa. Se investigaron ensayos de citotoxicidad, inhibición de la formación de biopelículas y actividad antimicrobiana contra varias cepas de A. baumannii aisladas de varios hospitales tailandeses de endolisinas de fusión.

Investigamos el genoma del fago vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865) para identificar el gen de la endolisina. Se ha detectado la endolisina (QHJ75684.1) en el genoma del fago vPhT2. El lysAB-vT2 contiene 187 residuos de aminoácidos, mientras que la fusión de lysAB-vT2 contiene 199 residuos de aminoácidos (Fig. 1A). Se detectó un dominio conservado en lisozima desde los aminoácidos 65 a 180 (Fig. 1A). La secuencia del gen de la endolisina vPhT2 produce una identidad de secuencia del 53,53–60,54 % con el gen de la endolisina del fago RL_2015 (número de acceso AJG41873.1) y el fago AM24 (número de acceso APD20282.1) (fig. 1B). En la Fig. 1C se muestra la comparación de la secuencia de aminoácidos de lysAB-vT2 con la endolisina del fago RL_2015 y el fago AM24.

Caracterización y análisis bioinformático de la endolisina LysVTh2 (lysAB-vT2). (A) Diagrama esquemático del dominio conservado de endolisina putativa (LysVTh2, lysAB-vT2) y fusión-LysVTh2 (fusión de lysAB-vT2). Este diagrama se predijo utilizando el servidor web de Pfam. (B) Árbol de consenso de Bootstrap que muestra la relación filogenética entre LysVTh2 (lysAB-vT2) y 16 lisinas de A. baumannii previamente informadas. La historia evolutiva se infirió utilizando el método Neighbor-Joining con 1000 replicaciones de arranque y se realizó en MEGA 11. (C) Análisis de comparación de vB_AbaM_PhT2 (LysVTh2, lysAB-vT2), AM24 (número de acceso APD20282.1) y RL-2015 (Nº de acceso AJG41873.1) endolisinas utilizando la comparación de secuencias múltiples mediante el algoritmo Clustal Omega.

Tanto lysAB-vT2 como lysAB-vT2-fusion se expresaron en forma soluble. Ambos rendimientos de proteína recombinante purificada fueron 5,16 y 4,44 mg por litro de cultivo. Las proteínas purificadas se examinaron mediante SDS-PAGE y se observaron bandas de aproximadamente 25 kDa, lo que corresponde a la masa molecular predicha de 25 kDa (Fig. 2).

Análisis de expresión de proteínas y ensayo de lisis en placa de endolisina (LysVTh2, lysAB-vT2) y fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion). Análisis SDS-PAGE para expresión y purificación de (LysVTh2, lysAB-vT2) y fusion-LysVTh2 (lysAB-vT2-fusion). Carril M, escalera de proteína preteñida BLUeye; Carriles 1, lisado bacteriano no inducido; Carril 2, lisado bacteriano inducido por IPTG; Carril 3, la endolisina purificada (LysVTh2, lysAB-vT2) y fusión-LysVTh2 (fusión de lysAB-vT2) después de la diálisis.

La proteína recombinante se utilizó en un ensayo de manchas en placa para determinar la actividad lítica de ambas endolisinas frente a células bacterianas crudas. Los resultados mostraron que ambas proteínas tenían actividad lítica frente a las cepas ATCC 19606, MDRAB y XDRAB de A. baumannii (Fig. 3). También tienen actividad lítica frente a otras células crudas Gram negativas, como E. coli, P. aeruginosa y K. pneumoniae (fig. 3). Sin embargo, no se detectó actividad lítica en la cepa grampositiva S. aureus. La zona de inhibición de LysVTh2 de fusión purificada fue más grande que la LysVTh2 purificada y la lisozima de clara de huevo (Tabla S1).

Ensayo de lisis en placa de la endolisina purificada (LysVTh2, lysAB-vT2) y fusión-LysVTh2 (fusión de lysAB-vT2) contra A. baumannii. El ensayo de lisis en placa de la endolisina purificada (LysVTh2, lysAB-vT2) y fusión-LysVTh2 (fusión de lysAB-vT2) contra A. baumannii se realizó utilizando células esterilizadas en autoclave de A. baumannii ATCC 19606, A. baumannii AB003 (MDRAB), A. baumannii AB329 (XDRAB), Sal. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 27736 y S. aureus ATCC 6538. Se usó lisozima de clara de huevo (EWL) como control positivo.

Comparamos la eficacia de dos endolisinas recombinantes determinando la MIC. La CIM de lysAB-vT2 o fusión de lysAB-vT2 purificada se analizó utilizando ensayos de inhibición del crecimiento bacteriano para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de células viables de A. baumannii ATCC 19606. Los resultados indicaron que la CIM de la fusión de lysAB-vT2 fue 2 mg/ml correspondiente a 100 µM, mientras que la MIC de lysAB-vT2 fue superior a 10 mg/ml (400 µM).

Evaluamos el efecto de la fusión lysAB-vT2 combinada con antibióticos, desinfectantes, metales pesados ​​y el bacteriófago vPhT2. Las CIM de todos los agentes probados se muestran en la Tabla S2. El efecto sinérgico de la fusión lysAB-vT2 se evaluó mediante un ensayo de inhibición del crecimiento a 0,25 × la MIC de dos agentes. Como se muestra en la Fig. 4A, la combinación de endolisinas más colistina y polimixina B exhibió una actividad antibacteriana elevada seguida de CuCl2 con un porcentaje de inhibición de 95,8, 73,1 y 31,5%, respectivamente (Tabla S3). Se observó una interacción baja con EDTA (16,3 %), ZnCl2 (7,4 %), compuesto de amonio cuaternario (7,3 %) e imipenem (5,9 %) con la fusión lysAB-vT2 (Tabla S3). No hubo interacción al combinar la fusión de lysAB-vT2 con cloroxilenol, hipoclorito de sodio y el bacteriófago vPhT2. Realizamos un ensayo de tablero de ajedrez para medir la sinergia antibiótica de colistina, polimixina B y CuCl2. Las concentraciones inhibitorias fraccionarias (FIC) para la combinación de fusión lysAB-vT2 con colistina fueron 9,76 y 0,5 ug/ml, polimixina B fue 11,71 y 0,5 ug/ml, y CuCl2 fue 10,15 ug/ml y 1,62 mM (Fig. 4B ). Los índices FIC de la fusión lysAB-vT2 y los tres agentes se calcularon como 0,25, lo que indica sinergismo (Fig. 4B).

Pruebas de detección y confirmación para la interacción sinérgica y la medición de la sinergia mediante análisis de tablero de ajedrez. (A) La tasa de inhibición del crecimiento (el gráfico de barras) de la fusión lysAB-vT2 con tres antibióticos (imipenem, colistina y polimixina B), tres desinfectantes (compuesto de amonio cuaternario, cloroxilenol, hipoclorito de sodio), dos metales pesados ​​(ZnCl2, CuCl2 ) y el bacteriófago vPhT2. Los datos se expresan como porcentaje medio ± DE de experimentos por triplicado. (B) ensayo de tablero de ajedrez de fusión de lysAB-vT2 con colistina, CuCl2 y polimixina B.

Para evaluar la potencia antimicrobiana de la fusión lysAB-vT2, se determinó la actividad antibacteriana de la fusión lysAB-vT2 sola y la fusión lysAB-vT2 en combinación con colistina contra varias cepas de A. baumannii y otras especies bacterianas (Tabla S4). Entre las 27 cepas de A. baumannii analizadas, 14 cepas se inhibieron con 2 mg/ml de enzima con un porcentaje de inhibición superior al 85 % (Fig. 4B y Tabla S5). Encontramos una mayor actividad antibacteriana de la fusión lysAB-vT2 más colistina, que puede inhibir las cepas E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 27736, A. baumannii MDRAB, XDRAB y NR resistentes a los fagos. Además, en combinación con la colistina, la enzima puede inhibir el crecimiento de 22 de las 26 cepas de A. baumannii con una inhibición de más del 90 % (Tabla S6). La enzima sola o la enzima con colistina mostraron una baja inhibición de A. baumannii resistente a la colistina (Fig. 5).

Actividad antibacteriana de lysAB-vT2-fusion y lysAB-vT2-fusion más colistina, polimicina B y CuCl2. Actividad antibacteriana de la fusión lysAB-vT2 (2 mg/ml) (barra negra), la fusión lysAB-vT2 más colistina (10 ug/ml + 0,5 ug/ml) (barra verde), la fusión lysAB-vT2 más polimixina B (10 ug/ml + 0,5 ug/ml) (barra azul), y lysAB-vT2-fusion más CuCl2 (10 ug/ml/1,62 mM) (barra roja) se determinó usando un ensayo de inhibición contra E.coli, P. aeruginosa , K.pneumoniae y varias cepas de A. baumannii.

Se ejecutó una prueba de estabilidad térmica para analizar la resistencia al calor de la actividad antibacteriana de la fusión lysAB-vT2. Nuestros datos mostraron que la fusión lysAB-vT2 retuvo la actividad antibacteriana con un porcentaje de inhibición de casi el 95 % después de la incubación a 20 °C. Los resultados de la fusión lysAB-vT2 después de incubar la enzima a 4, 20, 40 y 60 °C mostraron inhibiciones porcentuales de casi el 75 %. A 80 °C, el porcentaje de inhibición de la fusión lysAB-vT2 se redujo al 30 % (Fig. 6). El porcentaje de reducción de la concentración de proteína fue bajo a 4, 20 y 40 °C. Encontramos que el porcentaje de reducción de la concentración de proteína se redujo al 80% a 80 °C (Fig. 6).

Estabilidad térmica de la fusión lysAB-vT2. Se determinó la estabilidad térmica de la actividad antibacteriana de la fusión lysAB-vT2 mediante un ensayo de inhibición bacteriana con 2 mg/ml de fusión lysAB-vT2 después de la incubación a 4, 20, 40, 60 y 80 °C durante 20 min. La barra negra representaba el porcentaje de inhibición de la enzima después del tratamiento térmico y la barra gris representaba el porcentaje de reducción de la concentración de proteína.

Se determinó la destrucción del biofilm bacteriano y la citotoxicidad de la fusión lysAB-vT2 para evaluar los posibles usos de la fusión lysAB-vT2. El ensayo de biopelícula mostró que tras la exposición de 4 mg/ml de fusión de lysAB-vT2 y 1 × 108 PFU/ml de fago vPhT2 con biopelículas de A. baumannii de 72 h, encontramos una reducción significativa en las CFU remanentes en las biopelículas. Las concentraciones de enzima inferiores a 4 mg/ml aumentaron la formación de biopelículas (Fig. 7A).

Biopelícula y citotoxicidad de la fusión lysAB-vT2. (A) El ensayo MBEC cuantificó la interrupción de biopelículas maduras de A. baumanni AB183 mediante concentraciones variables de fusión lysAB-vT2. Se formaron biopelículas de A. baumanni AB183 en placas MBEC de 96 pocillos durante 3 días y se cuantificó la muerte de bacterias de biopelícula mediada por endolisina mediante un tratamiento posterior de 24 h usando diluciones de endolisina que miden solo células de biopelícula. (B) Efecto adyuvante de la fusión lysAB-vT2 (2 mg/ml) con tratamiento simultáneo y escalonado (después de 24 h) del bacteriófago vPhT2 (Φ2) en biopelículas maduras de A. baumanni AB183 * Los asteriscos indican P ≤ 0,05 *** Los asteriscos indican P ≤ 0,001.

Para evaluar el efecto adyuvante de la endolisina de fusión lysAB-vT2 con el fago vPhT2 en la eliminación de biopelículas de A. baumanni, el tratamiento se evaluó mediante exposición simultánea y secuencial. Nuestros datos muestran que el tratamiento secuencial de endolisina durante 24 h y luego el fago vPhT2 durante otras 24 h no disminuyó significativamente el número de CFU en la biopelícula (Fig. 7B). Sin embargo, el tratamiento simultáneo de biopelículas maduras de Acinetobacter por fusión lysAB-vT2 (2 mg/ml) y fago vPhT2 (1 × 108 UFP/ml) al mismo tiempo produce CFU significativamente más bajas en las biopelículas (p < 0,05), lo que sugiere el tratamiento de endolisina y fago es mejor que escalonado.

Para los ensayos de citotoxicidad, la actividad de LDH basal parecía ser relativamente alta, alrededor del 40 %. La fusión de LysAB-vT2 sola pareció conducir a un aumento aproximado del 10 % en la liberación de LDH de las células humanas T24 en comparación con la condición basal. Esto se devolvió como una diferencia estadísticamente significativa en relación con el grupo no tratado (*; p < 0,05). La incubación conjunta de la fusión de lysAB-vT2 con células humanas T24 infectadas con AB183 condujo a una reducción parcial de la liberación de LDH de T24 (~ 15% de disminución en comparación con las células con AB183 y vehículo vacío agregado), lo que indicó que la endolisina era capaz de inactivando AB183 a una concentración de 2 mg/ml, sin embargo, los niveles de citotoxicidad relativa permanecieron altos (~ 75%) (Fig. 8A).

Citotoxicidad de la endolisina (fusión- LysVTh2) para las células epiteliales humanas. AB183 se cultivó durante la noche en medio Leibovitz y se usó para infectar células durante 1 h antes de agregar 2 mg/ml de fusión lysAB-vT2 a muestras relevantes e incubar durante 23 h más. A continuación, se realizó un ensayo de citotoxicidad de LDH utilizando el kit Invitrogen CyQUANT. (A) Recuperación y citotoxicidad del tratamiento de fusión lysAB-vT2 de células epiteliales humanas T24 infectadas por A. baumanni AB183. (B) Citotoxicidad después de la recuperación de células epiteliales humanas T24 de la infección AB183 después del tratamiento con endolisina de fusión simultánea lysAB-vT2 y antimicrobianos; CuCl2 (1,62 mM) y sulfato de colistina (0,5 µg/ml).

Evaluar el potencial de uso de endolisinas con otros antimicrobianos, la citotoxicidad del tratamiento conjunto de células epiteliales humanas infectadas y no infectadas con la fusión lysAB-vT2 y los antimicrobianos: cloruro de cobre (CuCl2) y sulfato de colistina. El tratamiento de células epiteliales humanas T24 infectadas y no infectadas con AB183 con lysAB-vT2 (2 mg/ml) y cloruro de cobre (1,62 mM) no produjo diferencias significativas en la liberación de LDH en comparación con el control no tratado/no infectado. Lo mismo se encontró con la exposición de células T24 a la fusión lysAB-vT2 (2 mg/ml) y sulfato de colistina (0,5 µg/ml), sin diferencias en la citotoxicidad para las células T24 en comparación con los controles de liberación espontánea. La infección AB183 de células T24 también se trató con éxito en todas las combinaciones de tratamiento antimicrobiano (Fig. 8B).

Se han estudiado enzimas derivadas de bacteriófagos, como las endolisinas, para combatir la aparición de bacterias multirresistentes. En este estudio, investigamos la proteína endolisina de vPhT2.

La diversidad de endolisinas depende del dominio catalítico enzimático (ECD) responsable de escindir un enlace de peptidoglicano específico y de los dominios de unión celular (CBD), que son responsables de reconocer epítopos específicos en la pared celular bacteriana18. Las endolisinas con un dominio de unión a la pared celular (CBD) se identificaron solo en algunos bacteriófagos de A. baumannii que eran endolisinas ElyA1 y ElyA2 que contenían un dominio de unión a peptidoglicano PG3 en el extremo N-terminal (11). El análisis BLAST de lysAB-vT2 predijo un ECD y un dominio conservado de lisozima, pero faltaba un CBD en esta endolisina (Fig. 1A). Los ECD de las endolisinas lysAB-vT2 fueron una muramidasa (N-acetil-β-D-muramidasa) que escinde los enlaces β-1, 4-glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico y una N-acetilglucosamina, lo cual estaba de acuerdo con informes anteriores7, 8. Los estudios de relación filogenética entre lysAB-vT2 con otras lisinas de A. baumannii mostraron que está estrechamente relacionado con una endolisina del fago RL_2015 no clasificado y el fago AM24 aislado en 2014 (Moscú, Rusia)19.

Se expresaron y purificaron dos endolisinas recombinantes. De acuerdo con un informe anterior, encontramos que ambas endolisinas mostraron el espectro del tablero para lisar células esterilizadas en autoclave de bacterias Gram-negativas8. La MIC de lysAB-vT2 nativo fue superior a 10 mg/ml. Debido a la falta de CBD de la lysAB-vT2 nativa, la endolisina nativa no puede atravesar y alcanzar la capa interna de peptidoglicanos en el espacio periplásmico de las bacterias Gram-negativas17. Además, encontramos un mediador de lisis de holina (GenBank: QHJ75701.1) en el genoma de vPhT2. Las holinas son proteínas de membrana codificadas por fagos que controlan el acceso de las endolisinas codificadas por fagos al peptidoglucano y, por lo tanto, desencadenan el proceso de lisis. Las propiedades fisicoquímicas de las lisinas Gram-negativas, como la carga neta, la hidrofobicidad, el momento hidrofóbico y el índice alifático, son responsables de una mejor interacción con la envoltura Gram-negativa20. Por lo tanto, generamos la fusión de aminoácidos hidrofóbicos con endolisina de lysAB-vT2, ya que los polipéptidos hidrofóbicos habían permitido la penetración de la membrana externa21. En comparación con lysAB-vT2 nativo, la MIC de la fusión lysAB-vT2 se redujo a 5 veces y nos hemos centrado en la actividad de la fusión lysAB-vT2. La parte lipídica en el terminal C de la fusión lysAB-vT2 ayudó a anclar el antibiótico a la membrana de la bacteria a través de su parte lipídica, según lo informado por Anikin et al.22.

Las combinaciones de colistina y endolisina contra cepas clínicas de bacterias multirresistentes, como A. baumannii y P. aeruginosa, han sido reportadas in vitro e in vivo 8,11. Nuestro estudio encontró que las interacciones entre la fusión lysAB-vT2 tenían una actividad antibacteriana elevada con colistina, polimixina B y CuCl2. La colistina y la polimixina B son antibióticos con carga positiva que se unen a través de los grupos fosfato con carga negativa del lípido A y su cadena de grasa acilo terminal hidrófoba, lo que provoca una expansión de la membrana externa externa (MO)23. Se produce una permeabilización del OM, lo que permite que la endolisina atraviese el OM y rompa la hidrolización de la capa de peptidoglicano. No hubo diferencia en la combinación de fusión de lysAB-vT2 con imipenem al nivel de MIC de 0,25 × de ambos agentes. El imipenem, un antibiótico betalactámico de la clase de los carbapenémicos, actúa inactivando las proteínas fijadoras de penicilina (PBP). En el nivel sub-MIC, ambos agentes están limitados en su acceso al peptidoglicano debido a la presencia de la membrana externa bacteriana como barrera estructural. Además, los iones de cobre (Cu+) se han utilizado como agentes antimicrobianos en la agricultura y el cuidado de la salud. A niveles inferiores a la MIC, las células expuestas a las superficies de cobre pueden inducir daños en la membrana24 y permitir que la endolisina atraviese el MO para mejorar la actividad antibacteriana de la enzima. La fusión lysAB-vT2 más colistina puede inhibir el crecimiento de varias cepas de A. baumannii, como XDRAB, MDRAB, pero no la A. baumannii resistente a la colistina (COLRAB). Este fenómeno puede explicarse por el hecho de que la MIC de COLRAB en este estudio fue de 32 ug/ml y se utilizó una concentración baja de colistina (0,5 µg/ml), en combinación con enzima y esta concentración puede no ser suficiente para destruir el exterior. membrana externa (OM) de las cepas resistentes a la colistina y no permite que la enzima funcione.

Para aplicar la fusión lysAB-vT2 como producto antibacteriano en el entorno clínico, se determinaron la estabilidad térmica, los ensayos de biopelícula y la citotoxicidad de la fusión lysAB-vT2. Las pruebas de estabilidad térmica mostraron que la endolisina todavía funciona en un amplio rango de temperatura de 4 a 60 °C. Sin embargo, a 80 °C, el porcentaje de inhibición de la fusión lysAB-vT2 disminuyó debido a la desnaturalización de la proteína. De acuerdo con informes anteriores, la fusión lysAB-vT2 puede inhibir la formación de biopelículas y disminuir las biopelículas maduras10,25,26. Nuestro estudio encontró que 4 mg/ml de endolisina y el fago vPhT2 pueden inhibir las biopelículas maduras. La concentración de MBEC fue mayor que el nivel de MIC. Este fenómeno puede explicarse por la estructura de las biopelículas que están recubiertas por una matriz de sustancia polimérica extracelular (EPS)26 y contribuyen a un alto MBEC. Se encontró que la fusión lysAB-vT2 se puede usar de manera efectiva junto con la terapia con fagos para interrumpir las biopelículas de A. baumanni. Contrariamente a los hallazgos en la literatura que encuentran que la terapia antimicrobiana con fagos escalonados es más efectiva, se encontró que el tratamiento simultáneo que usa tanto el fago como la endolisina de fusión lysAB-vT2 al mismo tiempo es más efectivo que el tratamiento secuencial para interrumpir las biopelículas27. Esta ocurrencia puede explicarse porque, a diferencia de los antimicrobianos más tradicionales, las endolisinas de los fagos no interfieren con el ciclo de vida de los fagos dentro de las biopelículas.

En contradicción con informes anteriores, se descubrió que los fagos y las enzimas de los fagos de A. baumannii eran seguros y no presentaban citotoxicidad para las líneas celulares humanas12,16, incluso cuando se usaban en combinación con otros antimicrobianos. Nuestro estudio encontró que la endolisina es capaz de inactivar A. baumannii para causar toxicidad celular, sin embargo, los niveles relativos de citotoxicidad siguen siendo altos. Esto se debe al hecho de que se utilizó una alta concentración de la enzima en comparación con el estudio anterior.

En conclusión, clonamos y expresamos endolisina de fusión de aminoácidos hidrofóbicos de fago, fusión lysAB-vT2. Esta enzima tiene actividad antibacteriana, tiene la capacidad de disminuir el biofilm maduro y tiene un efecto sinérgico con la colistina. Combinada con colistina o sola, esta enzima puede inhibir varias cepas de A. baumannii, incluidas MDRAB, XDRAB y A. baumannii resistente a los fagos.

El bacteriófago vB_AbaM_PhT2 (vPhT2) (MN864865) se aisló y caracterizó como se describió anteriormente10. Para probar la actividad antibacteriana, utilizamos aislamientos de A. baumannii recolectados entre 2006 y 2021 de cinco hospitales en Tailandia y A. baumannii aislado en 2021 del entorno hospitalario del hospital de la Universidad de Naresuan (Tabla S1). Las cepas de A. baumannii fueron A. baumannii sensible a los medicamentos (NR), A. baumannii multirresistente a los medicamentos (MDRAB), A. baumannii extremadamente resistente a los medicamentos (XDRAB), A. baumannii resistente a los carbapenems (CRAB), A. baumannii resistente a la colistina baumannii (COLRAB), y cepas de A. baumannii resistentes a fagos (PRAB) de un estudio previo28. La susceptibilidad a los antibióticos de todos los aislamientos se determinó de acuerdo con CLSI 201729 y se muestra en la Tabla S1. Las cepas de A. baumannii se cultivaron en caldo o agar Luria-Bertani (LB). E. coli BL21 (DE3) recombinante que contenía las construcciones pET28a-lysAB-vT2 y pET28a-lysAB-vT2-fusion se cultivaron en caldo y agar Luria-Bertani (LB), complementado con 50 µg/ml de kanamicina y 10 µg/ml de cloranfenicol. El protocolo fue aprobado por el Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad de Naresuan y el número de proyecto fue NUIBC MI 64-08-32.

El gen de endolisina de vPhT2 (Número de acceso MN864865) flanqueado por los sitios de restricción BamHI y EcoRI en pET28a se generó usando un sistema de síntesis de genes (script de genes). Además, la fusión hidrofóbica de endolisina se generó en pET28a mediante la adición de un gen que codifica aminoácidos hidrofóbicos (FILIVFVLIIAP) en el extremo C-terminal. Los vectores pET28a que contenían el gen de la endolisina (lysAB-vT2) y la fusión hidrofóbica de la endolisina (lysAB-vT2-fusion), se transformaron en E. coli DH5α y los plásmidos se purificaron y subclonaron en E. coli BL21 (DE3) pLysS. Se usó digestión de restricción para verificar la integridad del fragmento clonado. Para la sobreexpresión de enzimas de fagos recombinantes, se indujo un cultivo en fase logarítmica de E. coli BL21 (DE3) pLysS que contenía pET28a con fusión de lysAB-vT2 o lysAB-vT2 (A600–0,5) mediante la adición de IPTG a la concentración final de 1 mM. Después de la incubación durante 4 h a 37 °C, las células se sedimentaron, lavaron y congelaron a -80 °C. Las células congeladas se resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis (NaCl 145 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,4). Las muestras se congelaron y descongelaron 3 o 4 veces y luego se añadieron 100 µl de Triton X-100 (conc. final 1 % v/v) y se sometieron a ultrasonidos en hielo hasta que se observó un lisado claro. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm a 4 °C durante 10 min. Los sobrenadantes (fracción soluble) se recogieron para purificar las proteínas recombinantes usando una columna de cromatografía de afinidad con etiqueta His (His·Bind Kits, Novagen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fracciones de proteínas purificadas se agruparon y dializaron contra tampón de diálisis durante la noche. La pureza de la proteína se comprobó mediante SDS-PAGE al 12 %, seguido de la tinción de los geles de SDS-PAGE con azul brillante de Coomassie G-250.

Los ensayos de lisis de placa se realizaron como se describió anteriormente7 usando células bacterianas de A. baumannii ATCC 19606, A. baumannii AB003 (MDRAB), A. baumannii AB329 (XDRAB), Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae ATCC 27736 o Staphylococcus aureus ATCC 6538. Las bacterias se cultivaron hasta la fase logarítmica media, se recogieron, se lavaron una vez y se suspendieron en PBS. A continuación, la suspensión se esterilizó en autoclave y se centrifugó. El sedimento resultante se resuspendió en PBS (2% [vol/vol] del volumen de cultivo inicial) y se usó como sustrato. Se colocaron 5 µl de enzimas purificadas (4 mg/ml) sobre la placa de agar (1,5 %) que contenía el sustrato (5 %). Se usó un volumen igual de 20 ug de lisozima de clara de huevo (EWL) como control. Las placas manchadas se incubaron a temperatura ambiente. Se observaron zonas claras y se midió el diámetro de las zonas claras.

La CIM de lysAB-vT2 o lysAB-vT2-fusion frente a aislados clínicos de A. baumannii ATCC 19606 y A. baumannii se determinó según el método estándar de microdilución en caldo del Clinical and Laboratory Standards Institute24. Brevemente, se prepararon diluciones en serie dobles de cada enzima en caldo Mueller Hinton (MHB) en una placa de microtitulación estéril con fondo en U de 96 pocillos. El inóculo se preparó cultivando A. baumannii en LBA y se mantuvo a 37 °C durante la noche. Las colonias de A. baumannii se resuspendieron en una solución de NaCl al 0,85 % a una concentración de inóculo de 0,5 McFarland usando un densitómetro para lograr una concentración de 1 × 105 CFU/ml. Cada pocillo se inoculó con 50 µl de solución bacteriana, de forma que la concentración final del inóculo fue de 0,5 × 105 UFC/pocillo. La placa se incubó a 37 °C durante la noche. MIC se definió como la concentración más baja de enzimas que inhibían el crecimiento visible.

Las interacciones entre lysAB-vT2 o lysAB-vT2-fusión con tres antibióticos (imipenem, colistina y polimixina B), tres desinfectantes (compuestos de amonio cuaternario (QAC), cloroxilenol, hipoclorito de sodio), dos metales pesados ​​(CuCl2, ZnCl2) y bacteriófagos Las vPhT2 se examinaron mediante un ensayo de inhibición del crecimiento a 0,25 × la MIC de dos agentes. El huésped para la prueba de todos los agentes fue ATCC 19606. Se usó A. baumannii AB329 para probar el bacteriófago. El porcentaje de inhibición se calculó como el siguiente formulario

Se utilizó el método de microdilución en caldo de tablero de ajedrez para determinar la interacción entre la fusión de lysAB-vT2 con los antibióticos seleccionados30. Los resultados de las pruebas de dos agentes que actúan individualmente o en combinación se usaron para calcular el índice FIC (FICI), que era la suma de las concentraciones inhibitorias fraccionarias (FIC) de dos agentes según la fórmula: Índice FIC = FIC de lysAB-vT2-fusion + FIC de antibiótico, donde FIC lysAB-vT2-fusion es la MIC de lysAB-vT2-fusion en la combinación/MIC de lysAB-vT2-fusion solo y FIC antibiótico es la MIC de antibiótico en la combinación/MIC de antibióticos solos.

El índice FIC de los agentes mejorados se interpretó de la siguiente manera: FIC ≤ 0,5, sinérgico; FICI = 0,5-4, aditivo o indiferencia; y FICI > 4, antagonista25.

Actividad antibacteriana de la fusión lysAB-vT2 contra E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, K. pneumoniae ATCC 27736 y varias cepas de A. baumannii, que eran cepas sensibles a los medicamentos (NR), A. baumannii multirresistente (MDRAB), A. baumannii extremadamente resistente a los medicamentos (XDRAB), A. baumannii resistente a los carbapenems (CRAB) y A. baumannii resistente a la colistina (COLRAB). Brevemente, A. baumannii se cultivó en agar LB y se incubó durante la noche a 37 °C. Luego, los cultivos se diluyeron en caldo LB, la turbidez de las suspensiones celulares se ajustó a un estándar equivalente a 0,5 McFarland medido con un densitómetro correspondiente a aproximadamente 1 × 108 CFU/ml. Las suspensiones celulares ajustadas se diluyeron 1:100 en caldo Mueller Hilton de doble refuerzo y se inocularon 50 µl en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo en U (Nunc, EE. UU.). Se añadieron a cada pocillo 50 µl de las enzimas a la concentración MIC (2 mg/ml) o enzimas (10 µg/ml) con colistina (0,5 µg/ml) a concentraciones inferiores a la MIC. Después de una incubación durante la noche a 37 °C, se añadieron 50 ul de TTC esterilizado por filtración al 0,1 % (Hi-media). La placa se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 3 h. La absorbancia a OD540 se midió utilizando un lector de microplacas multimodo Synergy 2 (BioTek Instruments, Winooski, VT, EE. UU.). El experimento se repitió dos veces con muestras por triplicado. El porcentaje de inhibición contra todos los A. baumannii se calculó como se describió anteriormente7.

Para determinar la estabilidad de la actividad antibacteriana en diversas condiciones de temperatura, se incubaron 2 mg/ml de fusión lysAB-vT2 a 4, 20, 40, 60 y 80 °C, cada uno durante 30 min. Después de la incubación, se determinó la actividad antibacteriana mediante un ensayo de inhibición bacteriana. La concentración de proteína se midió después del tratamiento térmico y se calculó el porcentaje de reducción de proteína.

Para el ensayo de biopelícula, la endolisina y el fago vPhT2 se aplicaron a una cepa productora de biopelícula A. baumannii AB183 de 72 h y la capacidad de la endolisina purificada para eliminar biopelículas de 72 h se evaluó mediante el ensayo de concentración mínima de erradicación de biopelícula (ensayo MBEC). Las biopelículas se cultivaron durante 72 h en caldo LB a 37 °C, se expusieron a concentraciones variables de endolisina purificada y a 1 × 108 UFP/ml de fago vPhT2 en caldo Mueller Hinton durante 24 h. Los ensayos de adyuvante de endolisina-fago se realizaron con el tratamiento de biopelículas AB183 maduras de 72 h con fago y endolisina de forma simultánea y secuencial, con tratamiento secuencial primero tratando biopelículas durante 24 h con fago vPhT2 y luego tratamiento posterior de 24 h con endolisina de fusión lysAB-vT2. Después del tratamiento, las biopelículas se sonicaron en PBS y el número de bacterias supervivientes en la biopelícula se cuantificó sembrando en placa la biopelícula sonicada que contenía PBS resultante para determinar la CFU. Para el ensayo de citotoxicidad, se usaron células epiteliales de vejiga urinaria humana T24 (ATCC® HTB-4™) y A. baumannii AB183 y se prepararon como se describió anteriormente (Styles 2020). Ensayo de citotoxicidad de LDH realizado con el kit Invitrogen CyQUANT según el protocolo del fabricante.

Todas las pruebas se realizaron de forma independiente por triplicado y los datos se presentaron como media ± desviación estándar. El análisis de datos se realizó utilizando ANOVA unidireccional para las comparaciones de grupos con el control y la prueba T no pareada para las comparaciones por pares (Fig. 7A). p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los conjuntos de datos para esta investigación se incluyen en las tablas complementarias.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de Newton Fund - NRCT Thailand Research and Innovation Partnership Fund, British Council Newton Fund Institutional Links Award, Application ID: 623760210 to SS and APS and by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) and University of Warwick financió Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP) [número de subvención BB/M01116X/1] a GKD, NB y APS.UL fue apoyado por The Royal Golden Jubilee Ph.D. Programa (PHD/0227/2560). GKD y NB tienen becas de doctorado financiadas por Midlands Integrative Biosciences Training Partnership. PT fue financiado por Institutional Links Grant (623760210), bajo el Fondo de Asociación de Investigación e Innovación del Reino Unido y Tailandia.

Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Naresuan, Muang, Phitsanulok, 65000, Tailandia

Sutthirat Sitthisak, Suphattra Manrueang, Supat Khongfak, Udomluk Leungtongkam, Rapee Thummeepak y Aunchalee Thanwisai

Centro de Excelencia en Biotecnología Médica, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Naresuan, Phitsanulok, 65000, Tailandia

Sutthirat Sitthisak

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Warwick, Coventry, CV4 7AL, Reino Unido

Nathan Burton, Gurneet K. Dhanoa, Timothy Tsapras y Antonia P. Sagona

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SS y APS: Conceptualización y supervisión del estudio; SS, APS, RT, AT: concibieron y diseñaron los experimentos; SS: interpretación de datos; SM, SK, UL, NB, GKD, PT: realizó el análisis de datos y bioinformático; UL, SM, SK, NB, GKD, PT: realizaron experimentos y prepararon las figuras, SS: escribieron el primer borrador del manuscrito; APS: editó el manuscrito; SS y APS: adquisición de financiación. Todos los autores han leido y aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Sutthirat Sitthisak o Antonia P. Sagona.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sitthisak, S., Manrueang, S., Khongfak, S. et al. Actividad antibacteriana de la endolisina de fusión de aminoácidos hidrofóbicos del fago vB_AbaM_PhT2, combinada con colistina contra Acinetobacter baumannii. Informe científico 13, 7470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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Recibido: 31 agosto 2022

Aceptado: 19 de abril de 2023

Publicado: 08 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33822-8

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